CAS9/gRNAシステムを用いたゲノム改変動物作製系の確立

利用CAS9/gRNA系统建立基因组修饰动物生产体系

基本信息

批准号：
25892010
负责人：
藤井渉
金额：
$ 1.75万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
财政年份：
2013
资助国家：
日本
起止时间：
2013-08-30 至 2015-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は、人工ヌクレアーゼであるCAS9/gRNAシステム（CRISPR/Casシステム）を利用したゲノム改変動物の作製法について、応用的な利用法の開発を目的として行った。はじめに、申請者がこれまでに確立した受精卵を介した高効率ゲノム改変が可能なシステムによって、複数遺伝子の破壊がどの程度の効率で行えるのかを検討した。3遺伝子を同時に対象にした場合、ほぼ全ての産子がトリプルノックアウトとなり、これらはＥＳ細胞を用いた従来法によるノックアウトマウスと同様の表現型を示したことから、このゲノム改変系が複数座位のゲノム改変動物の作製に有効であることが明らかとなった。続いて、人工ヌクレアーゼによるゲノム改変の課題となっている「オフターゲット効果」に対する回避法を検討するために、培養細胞で報告されているCAS9ニッカーゼとペアのgRNAによるオフセットニッキング法（ダブルニッキング法）がゲノム改変動物作製においてもオフターゲット回避に有効であるかを検討した。その結果、この方法は通常のCAS9ヌクレアーゼを利用した場合に認められたオフターゲット変異を回避しつつ、高効率にゲノム改変個体の作製が可能であることが明らかとなった。更に、このゲノム改変法を利用し、特定ゲノム領域の欠失、ペプチドタグなどの塩基配列のノックイン、1～数塩基の置換などを行ったマウスの作製が可能であり、こうしたゲノム改変はラットにおいても有効であることを明らかとした。以上より、申請者の確立した高効率CAS9/gRNAシステムを応用したオフセットニッキング法によって、オフターゲット変異を回避しつつ高効率に複雑なゲノム改変を施した動物を作製可能であることが明らかとなった。

进行这项研究的目的是开发一种使用CAS9/GRNA系统（CRISPR/CAS系统）（人造核酸酶）生产基因组修饰产物的应用方法。首先，我们研究了申请人如何通过一个系统通过迄今已建立的受精卵进行高效的基因组修饰的系统来有效地破坏多个基因。当三个基因同时靶向时，几乎所有的后代都被淘汰了三重，并且使用ES细胞使用常规方法显示出类似的表型与敲除小鼠的表型相似，这表明该基因组修饰的系统有效地在多个基因座上创建基因组修饰产物。接下来，为了研究一种避免“脱靶效应”的方法，这是对人造核酸酶修饰基因组修饰的挑战，我们研究了使用与Cas9 nickase配对的GRNA（在培养的细胞中据报道）是否有效地避免了基因组更改产物的非目标。结果，可以发现这种方法允许高效地产生基因组修饰的个体，同时避免使用正常Cas9核酸酶时观察到的脱靶突变。此外，使用这种基因组修饰方法，可以产生对特定基因组区域缺失的小鼠，诸如肽标签之类的碱基序列的敲击以及一对几个基础的取代，并且已经揭示了基因组修饰在大鼠中也有效。从上面可以揭示出使用申请人建立的高效CAS9/GRNA系统的偏移刻痕方法可以产生具有高效的复杂基因组修饰的动物，同时避免脱靶突变。