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CAS9/gRNAシステムを用いたゲノム改変動物作製系の確立

利用CAS9/gRNA系统建立基因组修饰动物生产体系

基本信息

批准号：
25892010
负责人：
藤井渉
金额：
$ 1.75万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
财政年份：
2013
资助国家：
日本
起止时间：
2013-08-30 至 2015-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は、人工ヌクレアーゼであるCAS9/gRNAシステム（CRISPR/Casシステム）を利用したゲノム改変動物の作製法について、応用的な利用法の開発を目的として行った。はじめに、申請者がこれまでに確立した受精卵を介した高効率ゲノム改変が可能なシステムによって、複数遺伝子の破壊がどの程度の効率で行えるのかを検討した。3遺伝子を同時に対象にした場合、ほぼ全ての産子がトリプルノックアウトとなり、これらはＥＳ細胞を用いた従来法によるノックアウトマウスと同様の表現型を示したことから、このゲノム改変系が複数座位のゲノム改変動物の作製に有効であることが明らかとなった。続いて、人工ヌクレアーゼによるゲノム改変の課題となっている「オフターゲット効果」に対する回避法を検討するために、培養細胞で報告されているCAS9ニッカーゼとペアのgRNAによるオフセットニッキング法（ダブルニッキング法）がゲノム改変動物作製においてもオフターゲット回避に有効であるかを検討した。その結果、この方法は通常のCAS9ヌクレアーゼを利用した場合に認められたオフターゲット変異を回避しつつ、高効率にゲノム改変個体の作製が可能であることが明らかとなった。更に、このゲノム改変法を利用し、特定ゲノム領域の欠失、ペプチドタグなどの塩基配列のノックイン、1～数塩基の置換などを行ったマウスの作製が可能であり、こうしたゲノム改変はラットにおいても有効であることを明らかとした。以上より、申請者の確立した高効率CAS9/gRNAシステムを応用したオフセットニッキング法によって、オフターゲット変異を回避しつつ高効率に複雑なゲノム改変を施した動物を作製可能であることが明らかとなった。

This study aims at the development of CAS9/gRNA system (CRISPR/Cas system) and its utilization in animal production. For example, if the applicant has a high rate of fertilization, the applicant may change the rate of fertilization to a higher level. 3. The expression of the same phenotype in ES cells is different from that in the case of the same locus, and the expression of the same phenotype in ES cells is different from that in the case of the same locus, and the expression of the same phenotype in ES cells is different from that in ES cells. In addition to the above, the author also pointed out that there is no need to change the topic of human behavior. As a result, this method is usually used in CAS9 cases, and it is recognized that the difference between the two is avoided, and the high efficiency is required to change the individual's operation. In addition, this must be changed to make use of the specific domain of the missing, the selection of the base of the array, the 1~ number of base of the replacement of the operation is possible, this must be changed to the selection of the base of the array. The above, the applicant must establish a high efficiency CAS9/gRNA file system to be used to avoid the high efficiency CAS9/gRNA file system.