ウイルス性肝炎治療抵抗性に関わる新たな宿主因子の解析

1.新たなHCVレプリコン増殖細胞;ネオマイシン耐性遺伝子とルシフェラーゼリポーター遺伝子の融合遺伝子を発現するキメラリポーターHCVレプリコン(Rep-Feo)RNAをHuh7細胞に導入し，G418選択によりFeoレプリコン恒常発現細胞株(Huh7/Rep-Feo)を樹立した。レプリコンRNAは、northern blottingにて確認し、ウイルス蛋白発現はwestern blottingよりHCV非構造蛋白NS5Aの存在にて確認した。2.ISG発現プラスミドベクターの構築；Human Liver cDNA library発現プラスミドを用いて，PCR法により遺伝子を増幅し，ISG発現プラスミドベクターを構築した。構築したISG:IP10, IL8, MxA, PKR, GBP-1, IFI-56K, 25OAS, IFP35, IRF-9,　IFI-6-16, ISG15, IFI-27, PLSCR1, TRAIL, LMP7-E, 9-27, RIG-G,　IRF-1。構築したISG発現プラスミドベクターを，培養細胞（Huh7, 293T）へ遺伝子導入し，回収した蛋白質を用いて，western blottingで，蛋白発現を確認した。発現の確認は、発現蛋白のC末端にアミノ酸標識が可能なプラスミドベクターを用いたので、アミノ酸標識を検出する抗体を用いて、目的蛋白の分子量を持って発現を確認した。3.ISG発現によるHCV感染培養系への影響の解析;Genotype 2a JFH1株由来HCV感染培養細胞にISG発現プラスミドベクターを遺伝子導入し，培養上清中のHCVコア抗原を測定し，HCV増殖抑制効果を解析したところ,IRF-1の他、GBP-1, IFI6-16,IFI-27を遺伝子導入すると、HCV増殖抑制が有意に認められることが明らかとなった。

1.新たなHCVレプリコン増殖細胞;ネオマイシン耐性遺伝子とルシフェラーゼリポーター遺伝子の融合遺伝子を発現するキメラリポーターHCVレプリコン(Rep-Feo)RNAをHuh7細胞に導入し，G418選択によりFeoレプリコン恒常発現細胞株(Huh7/Rep-Feo)を樹立した。レプリコンRNAは、northern blottingにて確認し、ウイルス蛋白発現はwestern blottingよりHCV非構造蛋白NS5Aの存在にて確認した。2.ISG発現プラスミドベクターの構築；Human Liver cDNA library発現プラスミドを用いて，PCR法により遺伝子を増幅し，ISG発現プラスミドベクターを構築した。構築したISG:IP10, IL8, MxA, PKR, GBP-1, IFI-56K, 25OAS, IFP35, IRF-9,　IFI-6-16, ISG15, IFI-27, PLSCR1, TRAIL, LMP7-E, 9-27, RIG-G,　IRF-1。構築したISG発現プラスミドベクターを，培養細胞（Huh7, 293T）へ遺伝子導入し，回収した蛋白質を用いて，western blottingで，蛋白発現を確認した。発現の確認は、発現蛋白のC末端にアミノ酸標識が可能なプラスミドベクターを用いたので、アミノ酸標識を検出する抗体を用いて、目的蛋白の分子量を持って発現を確認した。3.ISG発現によるHCV感染培養系への影響の解析;Genotype 2a JFH1株由来HCV感染培養細胞にISG発現プラスミドベクターを遺伝子導入し，培養上清中のHCVコア抗原を測定し，HCV増殖抑制効果を解析したところ,IRF-1の他、GBP-1, IFI6-16,IFI-27を遺伝子導入すると、HCV増殖抑制が有意に認められることが明らかとなった。