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ウイルス性肝炎治療抵抗性に関わる新たな宿主因子の解析

病毒性肝炎耐药相关新宿主因素分析

基本信息

批准号：
25893064
负责人：
井津井康浩
金额：
$ 1.75万
依托单位：
Tokyo Medical and Dental University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
财政年份：
2013
资助国家：
日本
起止时间：
2013-08-30 至 2015-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-25893064/
关键词：
ウイルス性肝炎

项目摘要

1.新たなHCVレプリコン増殖細胞;ネオマイシン耐性遺伝子とルシフェラーゼリポーター遺伝子の融合遺伝子を発現するキメラリポーターHCVレプリコン(Rep-Feo)RNAをHuh7細胞に導入し，G418選択によりFeoレプリコン恒常発現細胞株(Huh7/Rep-Feo)を樹立した。レプリコンRNAは、northern blottingにて確認し、ウイルス蛋白発現はwestern blottingよりHCV非構造蛋白NS5Aの存在にて確認した。2.ISG発現プラスミドベクターの構築；Human Liver cDNA library発現プラスミドを用いて，PCR法により遺伝子を増幅し，ISG発現プラスミドベクターを構築した。構築したISG:IP10, IL8, MxA, PKR, GBP-1, IFI-56K, 25OAS, IFP35, IRF-9,　IFI-6-16, ISG15, IFI-27, PLSCR1, TRAIL, LMP7-E, 9-27, RIG-G,　IRF-1。構築したISG発現プラスミドベクターを，培養細胞（Huh7, 293T）へ遺伝子導入し，回収した蛋白質を用いて，western blottingで，蛋白発現を確認した。発現の確認は、発現蛋白のC末端にアミノ酸標識が可能なプラスミドベクターを用いたので、アミノ酸標識を検出する抗体を用いて、目的蛋白の分子量を持って発現を確認した。3.ISG発現によるHCV感染培養系への影響の解析;Genotype 2a JFH1株由来HCV感染培養細胞にISG発現プラスミドベクターを遺伝子導入し，培養上清中のHCVコア抗原を測定し，HCV増殖抑制効果を解析したところ,IRF-1の他、GBP-1, IFI6-16,IFI-27を遺伝子導入すると、HCV増殖抑制が有意に認められることが明らかとなった。

1. A new HCV clone cell line (Huh7/Rep-Feo) was established when HCV clone (Rep-Feo)RNA was introduced into Huh7 cells and a new HCV clone resistant gene (Rep-Feo) was developed. The presence of HCV non-structural protein NS5A was confirmed by northern blotting and western blotting. 2. Construction of ISG gene library;Human Liver cDNA library; PCR method; amplification of ISG gene library; construction of ISG gene library. ISG:IP10, IL8, MxA, PKR, GBP-1, IFI-56K, 25OAS, IFP35, IRF-9, IFI-6-16, ISG15, IFI-27, PLSCR1, TRAIL, LMP7-E, 9-27, RIG-G, IRF-1. Construction of ISG development and identification of protein expression in cultured cells (Huh7, 293T). Identification of the discovery of the protein C-terminal amino acid marker for possible use, identification of the protein C-terminal amino acid marker for antibody use, and identification of the protein molecular weight of interest 3. Analysis of the effect of ISG expression on HCV infected culture lines;Genotype 2a JFH1 strain was introduced into HCV infected culture cells by ISG expression vector, HCV antigen in culture supernatant was measured, and HCV proliferation inhibition effect was analyzed.