錐体オプシンを用いた光遺伝学的手法による睡眠・覚醒制御システムの解析

使用视锥蛋白的光遗传学方法分析睡眠/觉醒控制系统

基本信息

批准号：
26882023
负责人：
前島隆司
金额：
$ 0.92万
依托单位：
Kanazawa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
财政年份：
2014
资助国家：
日本
起止时间：
2014-08-29 至 2015-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

視床下部及びモノアミン・コリン作動性神経系により形成される睡眠・覚醒制御システムについて、個々の神経系を結ぶ入出力回路の作動機序と機能的役割の解明をめざし、錐体オプシンを用いた光遺伝学的手法を導入し実験を行なった。マウスをモデル動物とし、視床下部オレキシン神経及び縫線核セロトニン神経の神経活動を光遺伝学的に操作し、睡眠・覚醒状態の変化を観察する実験系の立ち上げを行なった。長波長型及び短波長型錐体オプシンをそれぞれ励起波長の重ならない蛍光タンパク質eGFP及びmCherryで標識し、Cre-loxP部位組み換え反応により発現されるようアデノ随伴ウイルスベクターにクローニングした。実験には細胞特異的にCreリコンビナーゼを発現する遺伝子改変マウスを用い、オレキシン神経及びセロトニン神経への遺伝子導入のため、それぞれOrexin-Creマウスの視床下部外側野とSERT-Creマウスの背内側縫線核内にウイルスベクターを投与した。いずれの錐体オプシンもセロトニン神経特異的に発現し、最適波長の光照射により過分極応答を誘発させることをそれぞれ組織学及び電気生理学的手法により確認した。また視床下部においては一部非特異的発現が認められたが、オレキシン細胞においても錐体オプシンの活性化により過分極応答が誘導された。次に、脳波・筋電計測下の生体マウスにおいて、錐体オプシンを導入した神経核に対し光ファイバーを通して直接光照射を行ない、睡眠・覚醒状態の変化を観察する実験システムを構築した。予備的ながら光照射期間において睡眠・覚醒状態の変化を観察した。今後実験系の修正を適時行いつつ実験を重ね、厳密な対照実験との比較から慎重に結論を導出したい。錐体オプシンを用いた光遺伝学的手法は神経回路の機能的役割を解明するための一助となると期待される。

实验是通过使用金字塔opsin引入光遗传技术来进行的，目的是阐明连接单个神经系统的输入/输出电路的机制和功能作用，以阐明睡眠和唤醒控制系统由下甲胺和单氨基氨基氨基氨基氨基素 - 巧妙的神经系统形成。我们使用小鼠作为模型动物，启动了一个实验系统，该系统可以光遗传学操纵下丘脑OREXIN神经和Raphe核5-羟色胺神经的神经活性，并观察睡眠和唤醒的变化。分别用荧光蛋白EGFP和MCHERRY标记长波长和短波长锥蛋白，它们不会重叠激发波长，并将其克隆到与腺相关的病毒载体中，以通过Cre-LoxP位点重组反应表示。在实验中，使用了表达Cre重组酶的遗传改性小鼠，并分别将病毒载体施用到Orexin-Cre小鼠的下丘脑下侧场和Sert-Cre小鼠的背侧内侧Raphe核，以用于基因转移到甲蛋白和血清素神经中。通过组织学和电生理技术证实，这两个锥体蛋白在5-羟色胺神经中均特异性表达，并且最佳波长处的光照射分别诱导超极化反应。此外，尽管在下丘脑中观察到了某些非特异性表达，但由于锥体OPSIN的激活，在Orexin细胞中诱导了超极化反应。接下来，构建了一个实验系统，在该系统中，在脑电图和肌电图的活小鼠中，通过光纤纤维对神经核进行了直接光照射，该神经核与金字塔op蛋白引入的神经核，并观察到睡眠和清醒的变化。尽管在光照射期间观察到睡眠和清醒的初步变化。将来，我们将继续进行重复的实验，同时对实验系统进行及时的修改，并通过与严格的控制实验进行比较，仔细得出结论。使用锥体蛋白的光遗传学方法有望帮助我们了解神经回路的功能作用。