PCR-ELISA法を用いた簡便な微少残存白血病細胞検出法の開発

建立一种简单的PCR-ELISA法检测微小残留白血病细胞的方法

• 批准号: 15591120
• 负责人: 高橋 浩之
• 金额: $ 1.54万
• 依托单位: Yokohama City University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15591120/
• 关键词: 白血病; 微少残存病変; PCR-ELISA法

PCR-ELISA法の特異性の設定はじめにPCR-ELISA法の特異性をみるために、患者初発時検体を二つに分け、一つは一方のプライマーの5‘側をビオチン化し、もう一つはジゴキシゲニン化dCTPとともにPCRで増幅した。PCR産物を混合し過熱(95℃)により二本鎖DNAを変性した後、80℃にまで冷却して十分に再アニーリングさせた。これをストレプトアビジン化したELISA用プレートに添加することによりアジビン-ビオチン結合を起こし、十分に洗浄した後、ペルオキシダーゼ結合抗ジゴキシゲニン抗体と基質を加えて発色させ、その量を分光光度計で測定した。その結果、同一検体同士では十分な発色が得られるものの、異なった検体でも少なくない量の発色が検出された。これは本研究開始前に行った放射性同位元素を用いたパイロット研究の結果と同じであり、十分な特異性を得るためには、結合温度や頻回の洗浄だけでは不十分と考えられた。そこで他の因子(塩濃度や他の化合物(ホルムアミド、非特異的DNAなど)の添加)を加味した条件のもとで解析したところ、より特異的に発色する条件が得られた。PCR-ELISA法の感度の設定つぎに、初発時検体をコントロールDNAで段階的に希釈したものを対象として、上記の条件でPCR-ELISA法を行い、十分な感度が得られるかどうか検討した。その結果、10^<-2>までは特異的に検出できるものの、10^<-2>未満では非特的結合と同じレベルになってしまい、十分な検出感度が得られなかった。臨床応用可能な検出レベルは10^<-3>とされており、現在の方法では不十分と考えられた。このため、種々のパラメーターを変更しつつ、更なる検討を行っている。

PCR ELISA method の specificity の set は じ め に PCR ELISA method の specificity を み る た め に, patients first 発 検 body を つ に け, a つ は side の プ ラ イ マ ー の 5 'side を ビ オ チ ン し, も う a つ は ジ ゴ キ シ ゲ ニ ン the dCTP と と も に PCR で rights of し た. PCR products を mixed し overheating (95 ℃) に よ り 2 lock を DNA - sex し た, after 80 ℃ に ま で cooling し て very に again ア ニ ー リ ン グ さ せ た. こ れ を ス ト レ プ ト ア ビ ジ ン change し た ELISA with プ レ ー ト に add す る こ と に よ り ア ジ ビ ン - ビ オ チ ン combining を up こ し incorporated, very に し た, ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ combined anti ジ ゴ キ シ ゲ ニ と ン antibody matrix を plus え て 発 color さ せ, そ の quantity を spectrophotometer determination of で し た. そ の results, the same 検 body with "で は very な 発 color が must ら れ る も の の, different な っ た 検 body で も less な く な い quantity の 発 color が 検 out さ れ た. こ れ は に line before the start of this study っ た を radioactive isotopic elements with い た パ イ ロ ッ と の ト research results with じ で あ り, very な specificity を る た め に は frequency, combining temperature や back の だ at け で は not very と test え ら れ た. そ こ で he の factor (salt concentration や he の compounds (ホ ル ム ア ミ ド, non specific DNA な ど) の add) を flavored し た conditions の も と で parsing し た と こ ろ, よ り specific に 発 color す が る conditions have ら れ た. PCR ELISA method の sensitivity の set つ ぎ に, first 発 検 body を コ ン ト ロ ー ル DNA で Duan Jie's に 釈 し た も の を like と seaborne し て の conditions で PCR, remember - ELISA method line を い, very が な sensitivity ら れ る か ど う か beg し 検 た. そ の results, 10 ^ < - > 2 ま で は specific に 検 out で き る も の の, 10 ^ 2 < - > not against で は variety combination with じ と レ ベ ル に な っ て し ま い, very な が 検 out sensitivity to ら れ な か っ た. In clinical practice, 応 may be used for な検 to produce レベ な検 な検 10^<-3>とされてお, and the current <s:1> method で <e:1> is not very と to test えられた. こ の た め, kind of 々 の パ ラ メ ー タ ー を - more し つ つ, more な る 検 line for を っ て い る.

项目成果

小児AMLにおけるFLT3の遺伝子異常とMRD検出への応用

FLT3在儿童AML中的基因异常及其在MRD检测中的应用

• 发表时间: 2005
• 期刊: 日本小児血液学会雑誌 19・1
• 作者: Watanabe N;et al.;奥田 久美子 他
• 通讯作者: 奥田 久美子 他

N-(4-hydroxyphenyl)retinamide(4-HPR)Induces Leulcemia Cell Death via Generation of Reactive Oxygen Species

N-(4-羟基苯基)视黄酰胺(4-HPR)通过产生活性氧诱导白血病细胞死亡

• 发表时间: 2003
• 期刊: Int.J.Hematol 78・3
• 作者: H.Goto;et al.
• 通讯作者: et al.

高橋浩之 他: "小児AMLにおけるFCT3遺伝子のinternal tandow duplicationとD835α paint mutationの解析"臨床血液. 44・8. 652 (2003)

Hiroyuki Takahashi 等：“儿科 AML 中 FCT3 基因的内部 tandow 重复和 D835α 油漆突变分析”临床血液学 44・8（2003）。

H.Goto et al.: "N-(4-hydroxyphenyl)retinamide (4-HPR) induces leukemia cell death via generation of reactive oxygen species"Int.J.Hematol.. 78. 219-225 (2003)

H.Goto 等人：“N-(4-羟基苯基)视黄酰胺 (4-HPR) 通过产生活性氧诱导白血病细胞死亡”Int.J.Hematol.. 78. 219-225 (2003)

FDG-PETによるTリンパ性腫瘍の残存病変の評価

FDG-PET评估T淋巴肿瘤残留病灶

• 发表时间: 2004
• 期刊: 日本小児血液学会雑誌 18.1
• 作者: Takagi M;et al.;石田 周 他
• 通讯作者: 石田 周 他