PCR-ELISA法を用いた簡便な微少残存白血病細胞検出法の開発

建立一种简单的PCR-ELISA法检测微小残留白血病细胞的方法

基本信息

批准号：
15591120
负责人：
高橋浩之
金额：
$ 1.54万
依托单位：
Yokohama City University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2005
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15591120/
关键词：
白血病微少残存病変 PCR-ELISA法

项目摘要

PCR-ELISA法の特異性の設定はじめにPCR-ELISA法の特異性をみるために、患者初発時検体を二つに分け、一つは一方のプライマーの5‘側をビオチン化し、もう一つはジゴキシゲニン化dCTPとともにPCRで増幅した。PCR産物を混合し過熱(95℃)により二本鎖DNAを変性した後、80℃にまで冷却して十分に再アニーリングさせた。これをストレプトアビジン化したELISA用プレートに添加することによりアジビン-ビオチン結合を起こし、十分に洗浄した後、ペルオキシダーゼ結合抗ジゴキシゲニン抗体と基質を加えて発色させ、その量を分光光度計で測定した。その結果、同一検体同士では十分な発色が得られるものの、異なった検体でも少なくない量の発色が検出された。これは本研究開始前に行った放射性同位元素を用いたパイロット研究の結果と同じであり、十分な特異性を得るためには、結合温度や頻回の洗浄だけでは不十分と考えられた。そこで他の因子(塩濃度や他の化合物(ホルムアミド、非特異的DNAなど)の添加)を加味した条件のもとで解析したところ、より特異的に発色する条件が得られた。PCR-ELISA法の感度の設定つぎに、初発時検体をコントロールDNAで段階的に希釈したものを対象として、上記の条件でPCR-ELISA法を行い、十分な感度が得られるかどうか検討した。その結果、10^<-2>までは特異的に検出できるものの、10^<-2>未満では非特的結合と同じレベルになってしまい、十分な検出感度が得られなかった。臨床応用可能な検出レベルは10^<-3>とされており、現在の方法では不十分と考えられた。このため、種々のパラメーターを変更しつつ、更なる検討を行っている。

设置PCR-ELISA方法简介的特异性，以查看PCR-ELISA方法的特异性，将初始患者标本分为两个，其中一个在一个引物的5'侧在一个底漆的5'侧，另一个在PCR上与Digoxigigiginated DCTP一起放大。将PCR产物混合，并通过过热（95°C）将双链DNA变性，然后冷却至80°C，并允许完全重新进行。将其添加到链霉菌素化的ELISA板上，以引起糖脂 - 生物素结合，在彻底洗涤后，过氧化物酶偶联的抗二高氧蛋白抗体并添加了底物以形成颜色，并用分光光度计测量量。结果，尽管在同一标本之间获得了足够的颜色发展，但在某些情况下，即使是不同的标本，也检测到大量的颜色发展。这与使用放射性同位素在本研究开始之前进行的试点研究的结果相同，因此人们认为，仅结合温度和频繁洗涤将不足以获得足够的特异性。因此，在考虑其他因素（盐浓度和添加其他化合物（甲酰胺，非特异性DNA等））的条件下进行了分析，以及导致更具体的颜色发展的条件。接下来，使用PCR-ELISA方法来确定是否可以在上述条件下使用PCR-ELISA方法在用对照DNA分阶段稀释的初始标本来获得足够的灵敏度。结果，尽管可以检测到最高10^<-2>的特定检测，但如果达到10^<-2>，则达到了非特异性结合的水平，并且未获得足够的检测敏感性。可以在临床上应用的检测水平为10^<-3>，并且当前方法被认为不足。因此，在更改各种参数时正在进行进一步的考虑。