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PCR-ELISA法を用いた簡便な微少残存白血病細胞検出法の開発

建立一种简单的PCR-ELISA法检测微小残留白血病细胞的方法

基本信息

批准号：
15591120
负责人：
高橋浩之
金额：
$ 1.54万
依托单位：
Yokohama City University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2005
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15591120/
关键词：
白血病微少残存病変 PCR-ELISA法

项目摘要

PCR-ELISA法の特異性の設定はじめにPCR-ELISA法の特異性をみるために、患者初発時検体を二つに分け、一つは一方のプライマーの5‘側をビオチン化し、もう一つはジゴキシゲニン化dCTPとともにPCRで増幅した。PCR産物を混合し過熱(95℃)により二本鎖DNAを変性した後、80℃にまで冷却して十分に再アニーリングさせた。これをストレプトアビジン化したELISA用プレートに添加することによりアジビン-ビオチン結合を起こし、十分に洗浄した後、ペルオキシダーゼ結合抗ジゴキシゲニン抗体と基質を加えて発色させ、その量を分光光度計で測定した。その結果、同一検体同士では十分な発色が得られるものの、異なった検体でも少なくない量の発色が検出された。これは本研究開始前に行った放射性同位元素を用いたパイロット研究の結果と同じであり、十分な特異性を得るためには、結合温度や頻回の洗浄だけでは不十分と考えられた。そこで他の因子(塩濃度や他の化合物(ホルムアミド、非特異的DNAなど)の添加)を加味した条件のもとで解析したところ、より特異的に発色する条件が得られた。PCR-ELISA法の感度の設定つぎに、初発時検体をコントロールDNAで段階的に希釈したものを対象として、上記の条件でPCR-ELISA法を行い、十分な感度が得られるかどうか検討した。その結果、10^<-2>までは特異的に検出できるものの、10^<-2>未満では非特的結合と同じレベルになってしまい、十分な検出感度が得られなかった。臨床応用可能な検出レベルは10^<-3>とされており、現在の方法では不十分と考えられた。このため、種々のパラメーターを変更しつつ、更なる検討を行っている。

The specificity of PCR-ELISA is determined by the following parameters: the specificity of PCR-ELISA is determined by two parameters at the time of initial detection of the patient; the specificity of PCR-ELISA is determined by five parameters at the time of initial detection of the patient; the specificity of PCR-ELISA is determined by two parameters at the time of initial detection of the patient; and the specificity of PCR-ELISA is determined by two parameters at the time of initial detection of the patient. PCR products were mixed and heated to 95℃, then cooled to 80℃. The amount of the anti-HIV antibody matrix was determined by spectrophotometry after addition of the anti-HIV antibody matrix. The result is that the same model is different from the same model, and the same model is different from the same model. Before the start of this study, the results of the study on radioactive isotopes were analyzed. These factors (concentration, addition of other compounds (such as nonspecific DNA)) are the conditions for flavor analysis, and the conditions for specific color development. The sensitivity setting of PCR-ELISA method, the initial detection time, the detection time, the detection time. The results, 10^<-2><-2>The clinical application may be detected by 10 <-3>^ This is the first time I've ever been to a school.