白血病治療中や移植後の微少残存病変追跡に有用な遺伝子変異特異的PCR法の確立

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白血病など血液疾患に対する化学療法後の治療反応性の確認や寛解・骨髄移植後の再発評価において、微少残存病変(MRD)を経時的に観察することは、非常に重要である。MRDや循環腫瘍細胞の検出には、腫瘍細胞を反映できるマーカーを選択する必要がある。マーカーとしては染色体異常、キメラ遺伝子、免疫関連遺伝子再構成がある。今回の研究では、適用範囲が広く、白血病細胞を追跡できるマーカーとして遺伝子変異に注目した。そして、遺伝子変異を標的とした遺伝子変異特異的PCR法を構築し、その特異性、感度について検討を行った。3'末端を変異該当箇所の変異塩基に一致させ、変異箇所の5'側上流に相補塩基と異なる塩基(ミスマッチ塩基)および、結合親和性を高めるために、locked nucleic acid (LNA、リボヌクレオシドの2'部位の酸素原子と4'部位の炭素原子がメチレンを介して結合している2つの環状構造を持つ核酸)を挿入したプライマーを使用した結果、正常DNAには反応せず、変異・正常プラスミドを使用した検討でも、3'末端を変異DNAに一致させたのみのプライマーと比較して平均10^4倍(PCRサイクル数16回分,2^<16>=65536)の正常・変異DNA識別能を持つ非常に特異性の高いPCR法を構築することができた。修飾を行わないフプライマーを使用した定量PCRサイクル(threshold cycle)数に対する、ミスマッチ塩基やLNAを挿入したプライマーを使用した定量PCRサイクル数の違いは平均3サイクル未満に抑えられた。プライマー修飾による反応遅延も10倍未満(2^<3.2>=10未満)に抑えられた。臨床検体を使用した検出感度は1/10^3～1/10^4であった。今後の検討課題として、原発巣以外での再発を考え、循環末梢血中に存在する腫瘍細胞(循環腫瘍細胞)を検出・定量するために、さらに感度の向上が必要と考えられた。