白血病治療中や移植後の微少残存病変追跡に有用な遺伝子変異特異的PCR法の確立

建立用于追踪白血病治疗期间和移植后微小残留病的基因突变特异性PCR方法

• 批准号: 20930022
• 负责人: 松田 和之
• 金额: $ 0.37万
• 依托单位: Shinshu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Scientists
• 财政年份: 2008
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2008 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20930022/
• 关键词: 遺伝子変異特異的PCR法; 微少残存残存病変; 白血病

白血病など血液疾患に対する化学療法後の治療反応性の確認や寛解・骨髄移植後の再発評価において、微少残存病変(MRD)を経時的に観察することは、非常に重要である。MRDや循環腫瘍細胞の検出には、腫瘍細胞を反映できるマーカーを選択する必要がある。マーカーとしては染色体異常、キメラ遺伝子、免疫関連遺伝子再構成がある。今回の研究では、適用範囲が広く、白血病細胞を追跡できるマーカーとして遺伝子変異に注目した。そして、遺伝子変異を標的とした遺伝子変異特異的PCR法を構築し、その特異性、感度について検討を行った。3'末端を変異該当箇所の変異塩基に一致させ、変異箇所の5'側上流に相補塩基と異なる塩基(ミスマッチ塩基)および、結合親和性を高めるために、locked nucleic acid (LNA、リボヌクレオシドの2'部位の酸素原子と4'部位の炭素原子がメチレンを介して結合している2つの環状構造を持つ核酸)を挿入したプライマーを使用した結果、正常DNAには反応せず、変異・正常プラスミドを使用した検討でも、3'末端を変異DNAに一致させたのみのプライマーと比較して平均10^4倍(PCRサイクル数16回分,2^<16>=65536)の正常・変異DNA識別能を持つ非常に特異性の高いPCR法を構築することができた。修飾を行わないフプライマーを使用した定量PCRサイクル(threshold cycle)数に対する、ミスマッチ塩基やLNAを挿入したプライマーを使用した定量PCRサイクル数の違いは平均3サイクル未満に抑えられた。プライマー修飾による反応遅延も10倍未満(2^<3.2>=10未満)に抑えられた。臨床検体を使用した検出感度は1/10^3～1/10^4であった。今後の検討課題として、原発巣以外での再発を考え、循環末梢血中に存在する腫瘍細胞(循環腫瘍細胞)を検出・定量するために、さらに感度の向上が必要と考えられた。

Leukemia な ど blood disorders に す seaborne る の after chemotherapy in treatment of anti 応 の confirm や, understanding solution after bone marrow transplantation, の 発 review again 価 に お い て, micro - less residual disease (MRD) を 経 when に 観 examine す る こ と は, very important で に あ る. MRD や cycle swollen sores cells の 検 out に を は, swollen sores cells were で き る マ ー カ ー を sentaku す る necessary が あ る. Chromosomal abnormalities, キメラ legates 伝, and immune-related legates 伝 reconstitute がある. Today back to の research で は, suitable van 囲 が hiroo く, leukemia cells を tracing で き る マ ー カ ー と し て heritage 伝 sub - different に attention し た. そ し て, heritage 伝 sub - different を mark と し た heritage 伝 sub - different specific PCR method を constructing し, そ の specificity, sensitivity, に つ い て 検 line for を っ た. 3 'end を - different の should a place - different salt base に consistent さ せ, - different の a place 5' side high fill salt base と に phase different な る salt base (ミ ス マ ッ チ salt base) お よ び, combined with high affinity を め る た め に, locked nucleic acid (LNA, リ ボ ヌ ク レ オ シ ド の 2 'position の acid element atoms と 4 parts の carbon atoms が メ チ レ ン を interface し て combining し て い る 2 つ の ring structure を つ nucleic acid) を scions into し た プ ラ イ マ ー を use し た results, normal DNA に は anti 応 せ ず, - different normal プ ラ ス ミ ド を use し た beg で 検 も, 3' end を - DN A consistent に さ せ た の み の プ ラ イ マ ー と compare し て average 10 ^ 4 times (PCR サ イ ク ル number 16 points back, 2 ^ 16 > < = 65536), の normal variations, different DNA can identify を hold つ に specificity の を い PCR method to construct very high す る こ と が で き た. Modified line を わ な い フ プ ラ イ マ ー を use し た quantitative PCR サ イ ク ル (threshold cycle) number に す seaborne る, ミ ス マ ッ チ salt base や LNA を scions into し た プ ラ イ マ ー を use し た quantitative PCR サ イ ク ル number の violations い は average 3 サ イ ク ル not against に え suppression ら れ た. Youdaoplaceholder0 プラ による による による the modification of による is anti応 遅 and prolongs プラ by 10 times unfulfilled (2^<3.2>=10 unfulfilled)に inhibits えられた. The clinical 検 body を uses <s:1> た検 to generate a sensitivity of 検 1/10^3 to 1/10^4であった. Future の 検 for subject と し て, original 発 巣 outside で の again 発 を え, circulating in the peripheral blood test に exist す る swollen sores cells (circular swollen sores cells) を 検 out, quantitative す る た め に, さ ら の が up necessary と に sensitivity test え ら れ た.

项目成果

遺伝子点変異特異的定量PCR法による移殖後微少残存病変の評価

基因点突变特异性定量PCR法评价移植后微小残留病

• 发表时间: 2009
• 作者: 今井充;他;柴山正美;松田和之
• 通讯作者: 松田和之