老人性骨粗鬆症におけるDNA修復系の関与

DNA修复系统参与老年骨质疏松症

• 批准号: 15591998
• 负责人: 柴田 義幸
• 金额: $ 2.3万
• 依托单位: Nagasaki University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15591998/
• 关键词: FEN-1; WRN

1.FEN-1のWRN結合領域の決定・WRNのFEN-1結合領域(WRN/FBR)を大腸菌に過剰発現させ、その抽出液よりhis-tagged WRN//FBRをニッケルキレートレジンを用いて精製した。・^<35>SラベルしたFEN-1全長または各ドメインとhis-tagged WRN/FBRとの結合反応を行い、ニッケルキレートレジンを用いて結合たんぱく質を回収した。・SDS-PAGEにより結合たんぱく質の分析を行ったところ、FEN-1のC末33アミノ酸残基がWRNとの結合に重要であることが示唆された。2.In vivoにおけるFEN-1のWRNとの結合の確認・プラスミドベクターにFEN-1の全長、C末33アミノ酸残基を欠いたもの(FEN-1ΔC)、及びC末33アミノ酸残基(fragC)を挿入し、また同様にWRNのFEN-1結合及び核移行シグナル領域を挿入した。・上記FEN-1発現及びWRN発現プラスミドを293T細胞に導入し、それら細胞抽出液よりhis-taggedFEN-1及びその結合たんぱく質をニッケルキレートレジンを用いて回収した。・SDS-PAGEにより結合たんぱく質の分析を行ったところ、in vivoにおけるFEN-1とWRNの有意な結合は検出できなかった。3.FEN-1の細胞内局在の決定・pEYFP-C1にFEN-1全長またはfragCを挿入し、これらプラスミドをT24細胞株に導入した。・レーザー共焦点顕微鏡を用いてその局在を観察したところ、fragC領域に核小体移行シグナルが存在することが示唆された。4.トランスジェニックマウスの作成・I型コラーゲンプロモータの下流にmycタグを付けたヌクレアーゼ活性欠損型FEN-1を挿入したプラスミドを構築し、トランスジェニックマウスを作成した。・現在外来遺伝子を持つものが、オス1匹メス2匹確認できている。

1. Determination of WRN binding domain of FEN-1·WRN binding domain of FEN-1 (WRN/FBR), Escherichia coli, Escherichia coli <35>FEN-1 is a combination of WRN/FBR and FEN-1. SDS-PAGE analysis of WRN binding residues in FEN-1 2. Identification of WRN binding in FEN-1 in vivo. Identification of WRN binding in FEN-1 in vivo. Identification of WRN binding in vivo. FEN-1 discovery and WRN discovery are described above. Cell extracts from 293T cells are introduced into the cells and are tagged with FEN-1 and WRN. SDS-PAGE analysis of FEN-1 in vivo 3. The intracellular localization of FEN-1 was determined by introducing FEN-1 full-length fragment into T24 cell line pEYFP-C1. A confocal microscope is used to detect the presence of nucleosomes in the field. 4. Construction of the first type of FEN-1. Construction of the first type of FEN-1. Now the foreign heritage is holding the