老人性骨粗鬆症におけるDNA修復系の関与

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1.FEN-1のWRN結合領域の決定・WRNのFEN-1結合領域(WRN/FBR)を大腸菌に過剰発現させ、その抽出液よりhis-tagged WRN//FBRをニッケルキレートレジンを用いて精製した。・^<35>SラベルしたFEN-1全長または各ドメインとhis-tagged WRN/FBRとの結合反応を行い、ニッケルキレートレジンを用いて結合たんぱく質を回収した。・SDS-PAGEにより結合たんぱく質の分析を行ったところ、FEN-1のC末33アミノ酸残基がWRNとの結合に重要であることが示唆された。2.In vivoにおけるFEN-1のWRNとの結合の確認・プラスミドベクターにFEN-1の全長、C末33アミノ酸残基を欠いたもの(FEN-1ΔC)、及びC末33アミノ酸残基(fragC)を挿入し、また同様にWRNのFEN-1結合及び核移行シグナル領域を挿入した。・上記FEN-1発現及びWRN発現プラスミドを293T細胞に導入し、それら細胞抽出液よりhis-taggedFEN-1及びその結合たんぱく質をニッケルキレートレジンを用いて回収した。・SDS-PAGEにより結合たんぱく質の分析を行ったところ、in vivoにおけるFEN-1とWRNの有意な結合は検出できなかった。3.FEN-1の細胞内局在の決定・pEYFP-C1にFEN-1全長またはfragCを挿入し、これらプラスミドをT24細胞株に導入した。・レーザー共焦点顕微鏡を用いてその局在を観察したところ、fragC領域に核小体移行シグナルが存在することが示唆された。4.トランスジェニックマウスの作成・I型コラーゲンプロモータの下流にmycタグを付けたヌクレアーゼ活性欠損型FEN-1を挿入したプラスミドを構築し、トランスジェニックマウスを作成した。・現在外来遺伝子を持つものが、オス1匹メス2匹確認できている。