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Site-specific and high efficient epitranscriptomic manipulation based on the enzymatic activity

基于酶活性的位点特异性高效表观转录组操作

基本信息

批准号：
22H02210
负责人：
今西未来
金额：
$ 11.07万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

本年度は、CRISPR/dCas13と脱メチル化酵素FTOおよびALKBH5とを融合させたタンパク質を用いたin vitroにおける標的選択的脱メチル化評価系の構築を行った。大腸菌発現系を用いたタンパク質発現精製条件の最適化、ガイドRNAのin vitro合成、およびN6-メチルアデノシンを含む標的RNAの合成、精製法を確立した。また、複合体を必要としないシンプルな配列選択的脱メチル化系として、RNA結合タンパク質PUFと脱メチル化酵素とを融合させたタンパク質をデザインし、大腸菌発現系より精製して、配列選択的な脱メチル化能を解析した。脱メチル化の評価は、N6-メチルアデノシン感受性のエンドリボヌクレアーゼMazFを用いた電気泳動による評価および、SELECT法を用いて行った。PUFタンパク質は、通常８つのリピートから構成されており、対応するRNA８塩基に結合するが、このリピート中に含まれるRNAを認識するアミノ酸にアラニン置換を導入して、７塩基認識型、および6塩基認識型へと改変したPUF改変体を作製した。これらの変異体は8塩基認識型とオーバーラップする塩基配列を認識しつつ、8塩基認識型と比較してRNAへの結合親和性が弱まった一方で、６塩基認識型とFTOとの融合体は、より低濃度で標的とするPUF結合配列の近傍に存在するN6-メチルアデノシンに対して高いRNA脱メチル化活性を示した。より詳細な検討が必要ではあるが、この結果は、RNAへの結合が弱まることで、脱メチル化酵素がRNAから解離しやすくなり、酵素反応のターンオーバーが高まっている可能性を示唆しているといえる。

This year, CRISPR/dCas13 and ALKBH5 were selected for the construction of a molecular chemistry evaluation system. Optimization of conditions for purification of E. coli production system, establishment of methods for synthesis and purification of target RNA in vitro, and N6-mediated RNA synthesis. The complex is necessary for the purification and analysis of RNA binding proteins, PUFs, and enzymes. The N6-A-D-A-D- PUF is composed of 8-base RNA, 8-base RNA, 8-base RNA, 7-base RNA, 6-base RNA, and 8-base RNA. The binding affinity of FTO fusion with 8-base recognition type and 8-base recognition type is weak, while that of FTO fusion with 6-base recognition type is weak, and that of PUF fusion with low concentration is near the binding affinity of PUF fusion. The results show that RNA binding is weak, and enzyme dissociation is high.

项目成果

期刊论文数量（5）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

オフターゲットを低減した配列選択的RNA脱メチル化酵素の創製

创建减少脱靶的序列选择性 RNA 去甲基酶

DOI：
发表时间：
2023
期刊：
影响因子：
0
作者：
今西未来;音成兼光，浅見有璃，二木史朗
通讯作者：
音成兼光，浅見有璃，二木史朗

カスタム遺伝子制御：ゲノム編集のこれから

定制基因调控：基因组编辑的未来

DOI：
发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
0
作者：
Nomura K;Mori S;Fujikawa K;Osawa T;Tsuda S;Yoshizawa-Kumagaye K;Masuda S;Nishio H;Yoshiya T;Yoda T;Shionyu M;Shirai T;Nishiyama KI;Shimamoto K.;今西未来
通讯作者：
今西未来

Mechanisms and strategies for determining m6A RNA modification sites by natural and engineered m6A effector proteins

通过天然和工程化 m6A 效应蛋白确定 m6A RNA 修饰位点的机制和策略