肝細胞のがん化における細胞間相互作用を介した星細胞の役割

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肝癌発生に関してin vivo発がんモデルで検討した。野生型とサイトグロビン（Cytoglobin）ノックアウトマウスのそれぞれに、15日齢時に体重1 kgあたり6 mgのDiethylnitrosamine（DEN）を腹腔内投与し、12ヶ月間に亘って腫瘍形成を観察した。最終時点で肝臓と血清を採取し、一部のグループ（n = 3匹/グループ）は、単一細胞解析に使用した。門脈灌流により肝臓から非実質細胞を分離し、プロナーゼ・コラーゲナーゼ酵素的灌流法により単一細胞を採取し、洗浄、赤血球と死細胞を除去し、100万細胞/mlに調整し、細胞生存率はTrypan blue法で評価した。サンプルは、Chromium single cell 3' reagent kits version 2、chip and controller（10 X Genomics）を使用してドロップレットベースのRNA-seqで処理され、メーカーの推薦する条件に指示に従って解析した。3つの非実質細胞タイプ、肝星細胞（HSC）、クッパー細胞（KC）、肝類洞内皮細胞（LSEC）の特定マーカーを使用し、アノテーションステップでの初期データ解析を行ったところ、DEN処理された肝臓ではKCに2つのサブクラスター、LSECに4つのサブクラスター、およびHSCに4つのサブクラスターがあることが判明した。 CytoglobinノックアウトマウスのLSECとWTマウスのLSECを比較したところ、異なる遺伝子発現があることが判明し、log2が1以上とした場合150の遺伝子が変化した。変化したトップ10遺伝子には、Rgs5、Apoa2、Serping1、Gm8797、Fgb、Mup10、Sod3、Chchd2、Cxcl12、Ifitm1が含まれていた。