染色体不安定性に着目した大腸癌の抗癌剤耐性機序の解析

点击翻译按钮获取中文摘要

大腸癌患者よりpatient-derived organoid(PDO)を樹立し、以下の解析を行なった。1) 大腸癌患者からの治療前及び耐性獲得後のPDOの樹立：未治療の進行大腸癌(Stage IV) 58例よりPDOを樹立した。また、１次治療を行い効果判定でPD(進行)が認められた時点で再度内視鏡検査を行い耐性獲得PDOを４例樹立した。2) PDOにおける染色体分析とCIN-scoreの評価：治療前PDO25例と耐性PDO4例を用いて染色体Gバンド分析を行なった。また、全ゲノム解析データを基に染色体不安定性の定量的評価法を行い、Chromosomal Instability (CIN)-scoreを算出した。治療前PDO25例中CIN-high 10例、CIN-mediate 6, CIN-low 9例であった。耐性獲得後のPDO4例ではCIN-low 2例、CIN-mediate 2例であった。3) 治療前及び耐性PDOの染色体不安定性候補遺伝子の抽出：治療前のPDO25例の全ゲノム解析データを用いて、CIN-score highの治療前PDOのゲノム解析データからアミノ酸変異を伴う変異遺伝子を抽出し、CIN-score-lowのPDOの変異遺伝子を差引いて候補遺伝子を56個を絞り込んだ。このうち、文献検索などを行いCIN候補遺伝子を10個に絞り込んだ。4) PDOにおけるα-tubulin/cadherin1の蛍光標識：CIN-score lowの治療前PDOを対象に、染色体分の微小管を構成するα-tubulinをGFP-Puroで、細胞膜のcadherin1をRFP-Puroでtaggingした。高速レーザー共焦点顕微鏡 を用いて、細胞分裂を多色タイムラプス観察できることを確認した。念の為、別のより強い蛍光色素を用いてHistoneH2bを標識したPDOも作製した。