Elucidation of Inner Ear Development Mechanisms using multi-omics

本年度にまず行ったのは、マウス内耳の各早期発生段階（胎生9.5日～11.5日）における、細胞の単離を行うプロトコールの確立である。本研究で施行する予定の単一細胞の網羅的遺伝子解析のためには、細胞が完全に1個ずつに単離されていることが必須である。このためには、前処置や単離用の薬剤に何を用いるか、フィルターのサイズ、遠心のプロトコールなどを決定する必要がある。検証の結果、Cell recovery solutionで前処理後に、Accumaxを加えて、20 umのフィルターで処理、薬剤のクリーンアップのために200 g の遠心を3回行う、というプロトコールが、最もdoublet（2個の細胞が1個の細胞用に見える状態）の発生率と細胞死の発生率とのバランスが良かった。次に、上記プロトコールに基づいて、胎生9.5日～11.5日の1日毎に単離した細胞のラブラリーを作成して、単一細胞を用いたRNAシークエンスを行った。各日のサンプルからは、3500から7000個の単一細胞を単離することができた。各日のサンプルの1細胞当たり遺伝子数は、5500から6300と、以前我々が、公開されている全身のマウス胎児単一細胞遺伝子網羅的解析のデータから内耳上皮のみを抽出して行った解析の際の614よりはるかに多くの遺伝子のシークエンスを得ることができた。また、先行研究で同定していた内耳発生に重要と思われる遺伝子のうち、Early B cell factor 1（Ebf1）について、内耳発生期における発現量の検定を定量的RT-PCRを用いて行った。その結果、発生期間中全般に発現は認めるが、胎生13.5日での発現量が最も多いことが分かった。In situ hybridizationによる、内耳発生期における局在の検討も行っているところである。

本年度にまず行ったのは、マウス内耳の各早期発生段階（胎生9.5日～11.5日）における、細胞の単離を行うプロトコールの確立である。本研究で施行する予定の単一細胞の網羅的遺伝子解析のためには、細胞が完全に1個ずつに単離されていることが必須である。このためには、前処置や単離用の薬剤に何を用いるか、フィルターのサイズ、遠心のプロトコールなどを決定する必要がある。検証の結果、Cell recovery solutionで前処理後に、Accumaxを加えて、20 umのフィルターで処理、薬剤のクリーンアップのために200 g の遠心を3回行う、というプロトコールが、最もdoublet（2個の細胞が1個の細胞用に見える状態）の発生率と細胞死の発生率とのバランスが良かった。次に、上記プロトコールに基づいて、胎生9.5日～11.5日の1日毎に単離した細胞のラブラリーを作成して、単一細胞を用いたRNAシークエンスを行った。各日のサンプルからは、3500から7000個の単一細胞を単離することができた。各日のサンプルの1細胞当たり遺伝子数は、5500から6300と、以前我々が、公開されている全身のマウス胎児単一細胞遺伝子網羅的解析のデータから内耳上皮のみを抽出して行った解析の際の614よりはるかに多くの遺伝子のシークエンスを得ることができた。また、先行研究で同定していた内耳発生に重要と思われる遺伝子のうち、Early B cell factor 1（Ebf1）について、内耳発生期における発現量の検定を定量的RT-PCRを用いて行った。その結果、発生期間中全般に発現は認めるが、胎生13.5日での発現量が最も多いことが分かった。In situ hybridizationによる、内耳発生期における局在の検討も行っているところである。