EBVにコードされた小RNA(EBERs)による悪性形質転換メカニズムの解析

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研究代表者は、EBVによる悪性形質転換のメカニズムを明らかにするために、SAGE法(Serial Analysis of Gene Expression)を行った。SAGE法で発現に差のあった遺伝子についてノーザンプロット法、定量的リアルタイムPCR法、ウエスタンブロット法を用いてRNAレベルおよびタンパク質レベルでの発現を確認した。その中でも発現の差が顕著であったひとつについて特に注目し、BJAB細胞に導入して悪性形質転換が起こるかどうかの確認を行った。遺伝子導入にはエレクトロポレーション法を用い、発現の確認にはHAタグに対するウエスタンブロット法を用いた。遺伝子導入された細胞は10%FCS存在下および0.1%FCS存在下でより高い増殖能を示した。更に軟寒天中でのコロニー形成能およびスキッドマウス皮下での腫瘍形成能も大幅に上昇した。遺伝子導入された細胞とコントロール細胞に対してマイトマイシンC処理・紫外線処理を行い、アポトーシスがどの程度起こるかについて検討したところ、遺伝子導入細胞ではコントロール細胞に比べて強いアポトーシス抵抗性が観察された。BJAB細胞以外の細胞株でも同様の現象が観察されるか否かを確認するため、バーキットリンパ腫由来のEBV陽性細胞株であるDaudi細胞、Mutu I細胞に対して限界希釈法を用い、EBV陰性細胞株を樹立した。そのうちのMutu I-EBV(-)にSAGE法によって同定された遺伝子を導入したところ、BJAB細胞と同様の結果が得られた。また、この遺伝子の発現を減少させるためにRNAiやantisenseを用いた実験を行ったところ、この遺伝子産物の減少が細胞死を誘導することが示唆された。以上の結果を総合し、研究代表者は細胞の悪性化においてこの遺伝子が何らかの重要な役割を果たしていると考えている。