Elucidation of the cochlear development and inner ear pathology with imaging mass-spectrometry for the treatment of sensorineural hearing loss

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本年度は昨年度から引き続き、IMS用の標本作成方法の検討を行った。切片に関しては前年度までに、骨に囲まれた成体マウス蝸牛の切片を未固定、未脱灰で作成できるようになっており、蝸牛内の血管条、コルチ器、ライスネル膜などを切片上で同定することができるまでになっていた。本年は、この手法で作成した切片を用いて、laser micro dissection (LMD)を用いて、蝸牛切片内のさまざまな部位から網羅的なタンパク質同定（ショットガンプロテオミクス）用のサンプルを回収するプロトコールの作成を行った。その結果、野生型成体マウス蝸牛の有毛細胞などが含まれるコルチ器、血管条、蝸牛神経からサンプルを回収することが可能で、各サンプルを10ショットあるいは30ショットから回収して解析を行うこととした。一方、Whole mountの蝸牛サンプルを用いたLMDも試みたが、十分な試料を得ることができなかった。次に、加齢性感音難聴の蝸牛各部位からの網羅的タンパク質同定を行うため、C57BL/6Jマウスの6週齢（若年、正常聴力）、6か月齢（中年、高音中心の難聴）、12か月齢（高齢、聾）の蝸牛切片の準備を行った。さらに、加齢性難聴以外の感音難聴のモデル動物として、マウスの音響外傷モデル作成プロトコールの策定を行った。音響外傷用のスピーカーの配置方法、呈示する音響の周波数、音圧、呈示音響のモニタリング方法などを検討した。その結果、呈示音響を常にモニタリングしながら、呈示音圧の低下がある場合には音圧を調整しながら、110dBの音圧で、8～16 kHzのオクターブバンドノイズで2時間暴露する条件が、最も安定してtransient threshold shiftのモデルマウスを作成することが可能になった。