黒質神経細胞の培養とパッチレコ-ディング及び細胞内カルシウムイオン動態の解析

黑质神经元培养、斑片记录和细胞内钙离子动力学分析

基本信息

批准号：
03263208
负责人：
辰巳仁史
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Tokyo Medical and Dental University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1991
资助国家：
日本
起止时间：
1991 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

近年の神経生物学の研究から細胞の死に細胞内カルシウムイオン濃度の変動が関与していることが推測されているが、その機序の解明は始まったばかりである。本研究はパ-キンソン病において細胞死の起こる神経核である黒質の神経細胞をラット脳から単離し(あるいは培養の後)、ホ-ルセルパッチレコ-ディングによる細胞膜カルシウムチャネル電流の分析とカルシウムイオン濃度指示薬furaー2による細胞内カルシウムイオン濃度の光学的測定を行い、細胞内カルシウムイオン濃度の恒常性維持機構を研究した。実験には基底核神経細胞も比較のため用いた。これらの神経細胞では、膜脱分極に伴い膜電位依存性のカルシウムイオンチャネルが開き、細胞外液のカルシウムイオンが細胞内へ流入する。その量を膜電流量として記録測定する事ができた。このカルシウムイオンの流入にともない細胞内カルシウムイオン濃度の上昇が観察された。細胞内カルシウムイオン濃度の上昇は、流入カルシウムイオン量にほぼ比例しているが、流入カルシウムイオン量が大きくなると細胞内カルシウムイオン濃度の上昇が飽和する傾向が観察された。この脱分極刺激停止の後、細胞内カルシウムの濃度は約3から10秒の後に元のレベルに回復した。この回復過程は、温度依存性を示し、またこの回復過程がATPの阻害剤バナデイトや、水素イオンの濃度勾配を破壊するカルボニルサイアナイドにより阻害されることから、カルシウムイオンポンプによる汲み取りにより細胞内カルシウムイオン濃度が細胞外に較べて極めて低い濃度に保たれていることが推測された。また細胞外液のナトリウムイオン濃度を減少されると、細胞内カルシウムイオン濃度の回復が緩やかになることから、NaーCaイオン交換機構もこの回復過程に関与することが推測された。このように細胞内カルシウム濃度は、流入と汲み取りの間のバランスにより調節されていることが明らかになった。

最近的神经生物学研究推测，细胞内钙离子浓度的波动与细胞死亡有关，但是这种机制的机制才刚刚开始。这项研究分离了底本质的神经元（或在培养后）神经元，即pakkinson病中发生的神经核，与大鼠大脑中的神经核，以及通过钙离子浓度指标FURA-2，通过钙化浓度指标浓度，分析了Holcell patch记录的细胞膜钙通道电流和细胞内钙浓度的光学测量。在实验中，基底神经元也用于比较。在这些神经元中，膜电压依赖性钙离子通道随膜去极化开放，以及来自细胞外流体流入细胞的钙离子。该量可以记录并测量为膜电流的量。随着该钙离子的流入，观察到细胞内钙离子浓度的增加。细胞内钙离子浓度的增加几乎与有影响力的钙离子的数量成正比，但是随着影响力钙离子的增加，细胞内钙离子浓度增加的趋势。在这种去极化刺激停滞后，细胞内钙的浓度在大约3到10秒后恢复到其原始水平。这种恢复过程取决于温度，并且由于ATP抑制剂Vanadaite和Carbonyl Thianides抑制了这种恢复过程，这些恢复过程破坏了氢离子的浓度梯度，因此与用钙离子泵泵送相比，与细胞外钙相比，将细胞内钙离子浓度保持在极低的浓度。此外，当细胞外液中的钠离子浓度降低时，细胞内钙离子浓度的恢复变得更加逐渐逐渐逐渐逐渐逐渐逐渐逐渐逐渐逐渐逐渐逐渐逐渐逐渐逐渐逐渐逐渐逐渐逐渐逐渐逐渐变化，并且据推测，NA-CA离子交换机制也参与了此恢复过程。因此，已经揭示了细胞内钙浓度受流入和抽水之间的平衡来调节。