光ピンセットを用いて神経細胞の膜蛋白分子を捕捉する研究

光镊捕获神经细胞膜蛋白分子的研究

基本信息

批准号：
05858102
负责人：
辰巳仁史
金额：
$ 0.51万
依托单位：
Tokyo Medical and Dental University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至 1994
项目状态：
已结题

项目摘要

光ピンセットとは光の放射圧を用いて1mumあるいはそれ以下の微粒子を捕まえ操作する新しい光学技術である。光を用いるため非接触であること、またレーザー光を用いるため微小領域に集光することによって、目的の粒子にのみ力を作用されることができる。本研究ではラット海馬培養神経細胞の神経成長円錐の膜蛋白分子に、直系15〜40nm(ナノメートル、10億分の1メートル)の金粒子を付着させ、その相対的位置変化をビデオ強化型高倍率微分干渉顕微鏡により約10nmの位置精度で計測した。本研究はこのナノメートル測定技術の土台の上で、光ピンセットを用いて金粒子を捕捉し、金粒子の付着した単一蛋白分子を細胞膜上で操作を試みた。また膜蛋白分子の運動を制限している分子メカニズムについても検討を加えた。中枢神経海馬は、学習や記憶に関わるとされ脳の中の重要な部位である。生後1〜3日の動物の脳切片から微小ナイフにより切り出された海馬を酵素処理し神経細胞を単離し培養した。現有の7000倍の高倍率微分干渉顕微鏡で観察すると、3時間から24時間培養された神経細胞の神経突起には成長円錐が形成されることが確認できた。神経成長円錐に金コロイド粒子(直系40nm)を灌流投与し、高倍率微分干渉顕微鏡による神経成長円錐の映像をビデオ画像強調すると金コロイド粒子が膜表面に付着している様子が観察され、膜蛋白分子が金コロイド粒子で標識された事を確認できる。標識用金コロイド粒子が膜表面にコンカナバリンAを結合し、膜蛋白分子を特定することができた。高倍率微分干渉顕微鏡の細胞照明用の光路(落射光路)にレーザー光を導入し金粒子に集光すると、光ピンセットとして作用し金粒子を捕捉できることを確認できた。捕捉状態では、粒子は約直径100nmの円周内にとどまりレーザー光照射を止めると、ランダムな自由運動(ブラウン運動)を開始した。しかし全く自由なブラウン運動ではなく差し渡し数百ナノメータの微小な束縛域の存在を示唆するような運動であった。光ピンセットの捕捉点を細胞膜上で移動させると、金粒子も膜上を移動し、人為的に膜蛋白分子の移動が可能であることが判明した。この研究は生体機能高分子の1分子レベルでの操作技術および膜分子間に働く力の直接的測定法の開発と発展に寄与するものと考える。

光学镊子是使用光的辐射压力来捕获和操纵1MUM或更少的颗粒。通过使用光，它是非接触的，并将其集中在小面积以与激光一起使用，只能将力施加到目标颗粒上。在这项研究中，将直接15-40 nm（纳米，十亿分之一）的金颗粒连接到大鼠海马培养神经元中神经生长锥的膜蛋白分子上，并使用视频增强的高磁化差异干扰显微镜与大约10 nm的位置精度测量其相对位置变化。这项研究试图根据这种纳米测量技术使用光学镊子捕获金颗粒，并用附着在细胞膜上的金颗粒来操纵单蛋白分子。我们还研究了限制膜蛋白分子运动的分子机制。中枢神经系统海马是大脑的重要组成部分，据说与学习和记忆有关。海马由1至3天大的动物脑部的微动物切除，并经过酶处理以分离和培养。使用当前的高磁化差分干扰显微镜观察7,000次，证实生长锥在培养的神经元的神经元中形成3至24小时。当将胶体金颗粒（直接40 nm）灌注到神经生长锥上时，使用高磁化差异干扰显微镜对神经生长锥的增强进行了视频图像增强，这表明金胶体颗粒附着在膜表面上，确认了膜蛋白分子与金胶质胶质胶质粒子一起标记。标记的胶体金颗粒结合了胸甲甲藻蛋白与膜表面，从而鉴定出膜蛋白分子。可以证实，当激光光被引入光学路径（Epi-Light Path）中，以用于高磁化差分干扰显微镜的细胞照明并集中在金颗粒上时，它充当了光晶镊，可以捕获金颗粒。在被捕获的状态下，颗粒保持直径约100 nm并停止激光照射，并开始随机自由运动（布朗的运动）。但是，这不是一个完全自由的布朗运动，而是一个运动，表明存在数百纳米的小边界区域。已经发现，当光学镊子的捕获点在细胞膜上移动时，金颗粒也在膜上移动，从而使膜蛋白分子人为地转移。据信，这项研究有助于在单分子水平上为生物功能性聚合物的工程技术的开发和开发，并直接测量膜分子之间作用的力。