融合蛋白質を利用した膜貫通性蛋白質の配向性および組み込み機構の解析

利用融合蛋白分析跨膜蛋白的定向和整合机制

• 批准号: 04259225
• 负责人: 大隅 隆
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Himeji Institute of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1992
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1992 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-04259225/
• 关键词: ペルオキシソーム; ペルオキシソーム膜蛋白質; 3-ケトアシル-CoAチオラーゼ; 局在化シグナル; シグナルペプチド; 融合蛋白質; 蛍光抗体法

ペルオキシソーム膜の70kDa蛋白質(PMP70)の局在化シグナルを明らかにするため、PMP70の部分配列をアミノ末端側に、一方大腸菌のジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)の配列をカルボキシル末端側にもつ融合蛋白質を遺伝子工学的に構築した。この蛋白質をコードする遺伝子をチャイニーズハムスター卵巣来細胞(CHO)に導入して発現させ、作られた蛋白質の細胞内局在性を、抗DHFR抗体を用いた二重蛍光染色法によって調べた。その結果、PMP70の局在化にはアミノ末端側約220残基があれば十分であることがわかった。一方、やはりアミノ末端側にペルオキシソーム局在化シグナルをもつ3-ケトアシル-CoAチオラーゼについて調べた。すでにこの酵素の前駆体のアミノ末端延長ペプチドにシグナル活性が存在することを明らかにしていたので、今年度はこのシグナルのアミノ酸配列依存性を検討した。延長ペプチド部分をDHFRのアミノ末端に結合させた融合蛋白質をCHO細胞に発現させ、前述と同様の方法で分布を調べた。プロセシング部位から上流に向って17番目の残基であるヒスチジンを他のアミノ酸に置換したところ、グルタミンでは弱いながらも局在化活性を保持していた。しかし塩基性アミノ酸のリジンまたはアルギニンに置き換えると、ペルオキシソーム局在化活性は失われ、かわりに弱いミトコンドリア局在化活性が現れた。疎水性アミノ酸に置き換えても同様の結果が得られた。一方、中性の親水性アミノ酸あるいは酸性アミノ酸では、どちらのオルガネラへも輸送されなかった。これらの結果は、チオラーゼ延長ペプチドの局在性シグナルとしての機能が、少くとも問題のヒスチジン残基に関する限り厳密な配列依存性をもち、かつ正の電荷は活性に関与しないことを示している。チオラーゼのシグナルは、従来から知られているSKL型シグナルとは、異なる認識機構によって受容されると考えられる。

The 70kDa protein (PMP70) in the membrane of the protein is located in the middle of the protein chain, the partial alignment of PMP70 is located in the terminal side of the protein chain, and the alignment of the folate reductase (DHFR) in E. coli is located in the middle of the protein chain. The protein was introduced into CHO cells and expressed as a localized protein. Anti-DHFR antibodies were detected by double fluorescence staining. PMP70 is located on the terminal side of about 220 residues. On the other hand, the terminal side of the system is selected from the 3-part system. A study of the acid alignment dependence of the enzyme precursor on the terminal extension of the enzyme activity was carried out. The fusion protein was produced in CHO cells by the same method as described above. The residue of the 17-point chain is replaced by the weak one, and the chemical activity is maintained. In addition, it is necessary to improve the quality of the products and improve the quality of the products. The results of this study are as follows: One side, neutral and hydrophilic acid, acid The result is that there is no correlation between the function and the activity of the positive charge, and the correlation between the activity and the activity of the positive charge. The author of this paper is to discuss the relationship between the two organizations.

项目成果

MIURA,S.,KASUYA-ARAI,I.,MORI,H.,MIYAZAWA,S.,OSUMI,T.,HASHIMOTO,T.,FUJIKI,Y.: "Carboxyl-termial Consensus Ser-Lys-Leu-related Tripeptide of Peroxisomal Proteins Functions in Vitro as a Minimal Peroxisome-targeting Signal" The Journal of Biological Chemistr

MIURA,S.,KASUYA-ARAI,I.,MORI,H.,MIYAZAWA,S.,OSUMI,T.,HASHIMOTO,T.,FUJIKI,Y.：“羧基末端共有 Ser-Lys-Leu 相关三肽

KAMIJO,K.,KAMIJO,T.,UENO,I.,OSUMI,T.,HASHIMOTO,T.,: "Nucleotide Sequence of the Human 70KDA peroxisomal Membrace Protein:a memver of ATP-binding Cassette Transporters" Biochimica et biophysica Acta. 1129. 323-327 (1992)

KAMIJO,K.,KAMIJO,T.,UENO,I.,OSUMI,T.,HASHIMOTO,T.,：“人类 70KDA 过氧化物酶体膜蛋白的核苷酸序列：ATP 结合盒转运蛋白的记忆体” Biochimica et biophysicala Acta

OSUMI,T.,TSUKAMOTO,T.,HATA,T.: "Signal Peptide for Peroxisomal Targeting:Replacement of an Essential Histidine Residue by Certain Amino Acids Converts the Amino-Terminal Presequence of Peroxisoma13-Ketoacyl-CoA Teiolase to a Mitochondrial Signal Peptide K

OSUMI,T.,TSUKAMOTO,T.,HATA,T.：“用于过氧化物酶体靶向的信号肽：用某些氨基酸替换必需的组氨酸残基可将 Peroxisoma13-酮酰基-CoA Teiolase 的氨基末端前序列转化为线粒体信号肽