ペルオキシソームの形成に伴う蛋白質のソーティング機構

与过氧化物酶体形成相关的蛋白质分选机制

• 批准号: 06248227
• 负责人: 大隅 隆
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: Himeji Institute of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-06248227/
• 关键词: ペルオキシソーム; PPAR; RXR; ペルオキシソーム増殖剤; ペルオキシソーム形成因子; カタラーゼ; 蛍光抗体法; ペルオキシソーム欠損症

1.ペルオキシソーム増殖剤によるβ酸化系遺伝子の誘導に関与するといわれている核内レセプターのPPARの細胞内動態を、細胞へのトランスフェクション実験によって調べた。PPARの発現ベクターを種々の培養細胞に導入し、蛍光抗体法で観察したところ、PPARは核に局在することがわかった。また細胞の種類によっては、トランスフェクションが起こった細胞のうちPPARを発現している細胞が異常に少ないという現象が認められた。PPARとヘテロダイマーを形成するといわれているレチノイドXレセプター(RXR)を共発現させたところ、PPAR発現細胞の比率が顕著に上昇した。放射性メチオニンによるパルス標識実験の結果、発現の悪い細胞ほどPPARの寿命が短い傾向が見られたが、RXRの共発現によってそれが改善される兆候はなかった。このため細胞によるPPARの発現効率の差を、PPARの細胞内寿命から説明することはできなかった。2.ペルオキシソーム形成には多くの蛋白質因子が関与していると予測されるが、高等動物のそのような因子の同定は、あまり進んでいない。酵母で広く行われているような、突然変異株への相補活性に基づく遺伝子のクローニングは、技術的困難のためにひとつの因子(PAF-1)について成功しているのみであった。そこでこの困難を克服する試みを行った。一回の実験でスクリーニングできるクローンの数を飛躍的に高め、スクリーニングに要する時間を短縮することを目標に、遺伝的ペルオキシソーム欠損細胞に一過性にcDNA発現ライブラリーのプールをトランスフェクションし、ペルオキシソーム形成能を回復した細胞を抗カタラーゼ抗体を用いた蛍光抗体染色によって検出するという方法で実験を行った。この方法により実際に2カ月のうちに、35万個の独立cDNAクローンから、一個の新しい因子のクローン(PAF-2)を単離することに成功した。

1. The regulation of intracellular dynamics of PPAR in the nuclear system and the regulation of intracellular dynamics of PPAR in the cellular system. PPAR gene expression in cultured cells was detected by light antibody assay. The type of cell is abnormal, and the PPAR is abnormal. The percentage of PPAR positive cells increased significantly. The results of radioactivity detection, detection and detection of PPAR showed a tendency to shorten the life span of PPAR and RXR. The difference in PPAR production rate and the intracellular life span of PPAR are explained. 2. The formation of protein complex is related to the prediction of protein complex factors in higher animals. Yeast growth, mutation, complementary activity, genetic diversity, technical difficulties, factor (PAF-1), success, etc. Try to overcome these difficulties. The number of cells in a loop is rapidly increasing, the time is shortened, the target is shortened, the selection is delayed, the cells are damaged, the cDNA is generated transiently, the protein is formed, the cells are recovered, the antibody is detected, the light antibody is detected, and the method is carried out. The method was successful in identifying 350,000 independent cDNA fragments and one new gene (PAF-2).