平滑筋ミオシン軽鎖リン酸化酵素のアクチン結合と収縮制御

平滑肌肌球蛋白轻链激酶的肌动蛋白结合和收缩控制

基本信息

批准号：
05256202
负责人：
桑山秀人
金额：
$ 1.47万
依托单位：
Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

ウシ平滑筋におけるミオシン軽鎖リン酸化酵素(MLCK)として,分子量155kDaおよび130kDaの2種の成分が示された。ミオシン軽鎖のリン酸化活性とアクトミオシンの相互作用を活性化する作用は,2種のMLCKで必ずしも一致しないことから,我々は,分子量の大きい155kDa成分を制御因子(Ln)と考えている。これまで155kDa成分は煩雑な操作により分離されてきたが,今回は20mM MgCl_2による選択的抽出法と中性条件でのQAE-トヨパールカラムクロマトグラフィーを組み合わせる方法が確立され,研究を容易に進めることが可能となった。ウシ平滑筋155kDa成分のN末端はブロックされておりペプチドシーケンサーによる分析結果は得られなかった。一方,130kDa成分については,電気泳動したゲルをニトロセルロース膜に転写した後,膜を切り取り,ペプチドシーケンサーで分析すると,VKPAETPKPL-の配列が得られた。130kDa成分は蛋白分解酵素により155kDa成分のN末端側を切断された分解産物であり,分解で失ったN末端部分がアクトミオシン活性化に重要な機能を担うことを示している。トリ砂嚢MLCKを抗原として作成した単クローン抗体(GK127)は,ウシ平滑筋155kDa成分と免疫交差反応性を示すが,130kDa成分とは反応しないので,GK127を155kDa成分のN末端部分を追跡するプローブとして用いた。ギ酸中で155kDa成分をBrCN分解すると分解断片のうちGK127と反応する成分としては,52kDaペプチドおよび少量の44kDaペプチドが得られた。これらのペプチドは,両者ともにN末端アミノ酸を見いだせないことから155kDa成分のN末端側ペプチド断片と結論された。これらN末端BrCNペプチドは,スピードバックコンセントレータで過剰のBrCNを除いた後,中性条件下,GCL2000をもちいた高速液体ゲル濾過クロマトグラフィーをおこなうと高収量で調製できた。分離ペプチドは平滑筋アクチンフィラメントと堅く結合した。

显示了牛平滑肌中肌球蛋白轻链磷酸酶（MLCK）的两个成分，分子量为155 kDa和130 kDa。由于肌球蛋白轻链的磷酸化活性和肌动蛋白相互作用的活性不一定与两个MLCK相匹配，因此我们认为具有较大分子量的155 kDa成分是调节剂（LN）。到目前为止，已经通过复杂的操作将155KDA组件通过复杂的操作分离，但是在中性条件下已经建立了一种将选择性提取与20mm MGCL_2与QAE-Toyopearl柱色谱法结合的方法，从而可以轻松进行研究。牛平滑肌成分的N末端155KDA被阻断，并且未获得使用肽序列的分析结果。另一方面，对于130 kDa分量，将电泳凝胶转移到硝酸纤维素膜上后，切除膜并使用肽序列仪进行分析以获得VKPAETPKPL-exence。 130 kDa成分是一种降解产物，通过蛋白酶在155 kDa成分的N端裂解，表明N-末端部分在降解中丢失在肌动蛋白激活中起重要功能。单克隆抗体（GK127）使用鸟类Gisstella MLCK制成的抗原与155 kDa成分的牛平滑肌的免疫反应性，但与130 kDa的组件没有反应，因此GK127用于跟踪N-Termental intermalinal of the termalnical intermalinal of 155 Kda sda coundention coundention coundention coundentions coundentions。当在甲酸中降解155 kDa成分时，获得52 kDa肽和少量44 kDa肽的成分，它们是在降解片段中与GK127反应的成分。这些肽被认为是具有155 kDa成分的N末端肽片段，因为它们都没有发现N末端氨基酸。这些N末端BRCN肽是通过用快速浓缩器去除多余的BRCN并在中性条件下用GCL2000进行高性能的液体凝胶过滤色谱法来制备高产的。分离的肽牢固地与平滑肌肌动蛋白丝结合在一起。