平滑筋ミオシン軽鎖リン酸化酵素のアクチン結合と収縮制御

平滑肌肌球蛋白轻链激酶的肌动蛋白结合和收缩控制

• 批准号: 05256202
• 负责人: 桑山 秀人
• 金额: $ 1.47万
• 依托单位: Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-05256202/
• 关键词: ミオシン軽鎖キナーゼ; ライオトニン; 平滑筋; アクチン; カルシウム; カルモジュリン

ウシ平滑筋におけるミオシン軽鎖リン酸化酵素(MLCK)として,分子量155kDaおよび130kDaの2種の成分が示された。ミオシン軽鎖のリン酸化活性とアクトミオシンの相互作用を活性化する作用は,2種のMLCKで必ずしも一致しないことから,我々は,分子量の大きい155kDa成分を制御因子(Ln)と考えている。これまで155kDa成分は煩雑な操作により分離されてきたが,今回は20mM MgCl_2による選択的抽出法と中性条件でのQAE-トヨパールカラムクロマトグラフィーを組み合わせる方法が確立され,研究を容易に進めることが可能となった。ウシ平滑筋155kDa成分のN末端はブロックされておりペプチドシーケンサーによる分析結果は得られなかった。一方,130kDa成分については,電気泳動したゲルをニトロセルロース膜に転写した後,膜を切り取り,ペプチドシーケンサーで分析すると,VKPAETPKPL-の配列が得られた。130kDa成分は蛋白分解酵素により155kDa成分のN末端側を切断された分解産物であり,分解で失ったN末端部分がアクトミオシン活性化に重要な機能を担うことを示している。トリ砂嚢MLCKを抗原として作成した単クローン抗体(GK127)は,ウシ平滑筋155kDa成分と免疫交差反応性を示すが,130kDa成分とは反応しないので,GK127を155kDa成分のN末端部分を追跡するプローブとして用いた。ギ酸中で155kDa成分をBrCN分解すると分解断片のうちGK127と反応する成分としては,52kDaペプチドおよび少量の44kDaペプチドが得られた。これらのペプチドは,両者ともにN末端アミノ酸を見いだせないことから155kDa成分のN末端側ペプチド断片と結論された。これらN末端BrCNペプチドは,スピードバックコンセントレータで過剰のBrCNを除いた後,中性条件下,GCL2000をもちいた高速液体ゲル濾過クロマトグラフィーをおこなうと高収量で調製できた。分離ペプチドは平滑筋アクチンフィラメントと堅く結合した。

Two components of MLCK, with molecular weights ranging from 155kDa to 130kDa, are shown. Two MLCK species have the same molecular weight as the control factor (Ln) of 155kDa. The 155kDa component was isolated by the extraction method of 20mM MgCl_2 and the QAE method was established under neutral conditions. The study was easy to proceed. The N-terminal portion of the smooth muscle 155kDa component was analyzed. On the other hand, the 130kDa component was isolated from the membrane by electrophoresis, and the VKPAETPKPL-alignment was obtained after the membrane was cut and analyzed. The 130kDa component plays an important role in proteolytic enzyme activity and the 155kDa component in N-terminal cleavage. The antigen of MLCK was prepared from a single antibody (GK127), which was used to track the 155kDa component of the smooth muscle and the immune cross-reactivity, the 130kDa component and the N-terminal portion of the 155kDa component. The 155kDa component of the acid was decomposed into fragments of GK127 and a small amount of 44kDa was obtained. The N-terminal fragment of the 155kDa component was found to be in the middle of the reaction. After removing the BrCN from the N-terminal, the GCL2000 is filtered at high speed and modulated at high temperature. The separation of the two sides of the river is smooth and smooth.

项目成果

Grammer,J.C.: "Photoaffinity labeling of skeletal myosin with 2-azidoadenosine triphosphate" Biochemistry. 32. 5725-5732 (1993)

Grammer，J.C.：“用 2-叠氮基腺苷三磷酸对骨骼肌球蛋白进行光亲和标记”生物化学。

Kuwayama,H.: "Amino acid sequence of myosin light chain kinase from bovine stomach with special references to its actin binding domain" Biomed.Res.14. 113-116 (1993)

Kuwayama,H.：“来自牛胃的肌球蛋白轻链激酶的氨基酸序列，特别提及其肌动蛋白结合域”Biomed.Res.14。