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内皮由来弛緩因子(EDRF)による血管平滑筋弛緩の機序の研究(Cyclic GMP/G-kinaseによるリン酸化の基質となる240 KDaタンパク質の役割の解明)

研究内皮源性松弛因子 (EDRF) 的血管平滑肌松弛机制（阐明作为环 GMP/G 激酶磷酸化底物的 240 KDa 蛋白质的作用）

基本信息

批准号：
05256219
负责人：
今井昭一
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Niigata University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-05256219/
关键词：
cGMP G-kinase ブタ大動脈平滑筋 Calmodulin 240 kDaタンパク Heparin IP_4 IP_3受容体 Concanavalin A

项目摘要

ニトログリセリンを代表とする所謂亜硝酸薬、血管内皮細胞由来弛緩因子、心房性利尿ペプチド等は、guanylate cyclaseを活性化し、cGMP濃度上昇を起こして作用すると考えられているが、cGMP以降の機序に関しては、cGMP依存性タンパク質リン酸化酵素(G-kinase)による細胞膜Ca^<2+>-pumpの活性化が考えられているものの、なお不明な点が多い。我々は、G-kinaseの基質となりG-kinaseによる細胞膜Ca^<2+>-pumpの活性化に関与するタンパクの同定を目標に研究を進め、Ca^<2+>-pump自身はG-kinaseの基質でなく、Ca^<2+>-pumpの活性化と密接に関係したリン酸化は、分子量240 kDaのタンパクに起る事を見出したが、その後、膜内在性と考えられるこのタンパクが、calmodulin、concanavalin A、heparinに結合する性質を持つ事がわかり、Triton X-100で可溶化後、3段階(calmodulin、concanavalin A、heparin)のaffinity chromatographyを行う事により、SDS-PAGE上、殆ど単一のバンドを示す所まで精製する事ができる様になった。そこで、精製タンパクのアミノ酸配列について予備的な検討を行った所、アミノ酸21個の配列がラット及びマウスの小脳IP_3受容体の配列と完全に一致する断片が見出されたので、同じくheparin結合性で、分子量の良く似た糖タンパクであるinositol 1,4,5-trisphosphate(IP_3)受容体と比較しながら、IP_3結合性について検討を行った。その結果、IP_3を単一の部位に高い親和性で結合する事(IP_4の親和性は、IP_3の約1/60)、結合の比活性は精製と共に上昇する事、結合はIP_3受容体の拮抗薬であるheparinで、完全に抑制される事、等が明かとなった。240 kDaタンパクは、蔗糖密度勾配遠心分離で、IP_3結合活性と常に行動を共にするし、小脳から精製したIP_3受容体とほぼ同じ位置に沈降する。一方、240 kDa蛋白質に比べると程度は明らかに弱いが、小脳のIP_3受容体も、G-kinaseによってリン酸化されるので、240 kDaタンパクは、IP_3受容体ファミリーの一員であろうと考え、更に検討中である。

The mechanism of activation of guanylate cyclase and cGMP down-regulation is related to the activation of Ca^<2+>-pump in the cell membrane by cGMP dependent enzyme (G-kinase). The relationship between the activation of Ca^<2+>-pump and the stability of Ca^<2+>-pump in G-kinase matrix was studied. The relationship between Ca ^<2 +>-pump activation and the stability of Ca^<2+>-pump in G-kinase matrix was studied. The relationship between Ca ^<2 +>-pump activation and the stability of Ca^<2+>-pump in G-kinase matrix was studied. The relationship between Ca^<2+>-pump activation and the stability of Ca ^<2 +>-pump in G-kinase matrix was studied. Concanavalin A, heparin binding properties, Triton X-100, solubilization, three-stage (calmodulin, concanavalin A, heparin) affinity chromatography, SDS-PAGE, almost a single point of view, purification, etc. The alignment of 21 amino acids and 21 amino acids in the IP_3 receptor was completely consistent. The fragments were found to have the same heparin binding property and good molecular weight as the inositol 1,4,5-triphosphate (IP_3) receptor. The results showed that IP_3 had high affinity (IP_4 affinity was about 1/60 of IP_3 affinity), specific binding activity increased, binding to IP_3 receptor antagonized, completely inhibited, etc. 240 kDa sucrose concentration, sucrose density, IP_3 binding activity, common action, purification, IP_3 receptor and precipitation at the same location One side, 240 kDa protein ratio, degree of change, weak, small, IP_3 receptor, G-kinase, 240 kDa protein ratio, IP_3 receptor, member of the research, more detailed discussion.