標的遺伝子組換えによるアミロイド前駆体たんぱく遺伝子の生体機能の研究

通过靶向基因重组研究淀粉样前体蛋白基因的生物学功能

• 批准号: 05261210
• 负责人: 安波 道郎
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Kumamoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-05261210/
• 关键词: 標的遺伝子組換え; 未分化胚幹細胞; アルツハイマー病; アミロイド前駆体たんぱく

アミロイド前駆体たんぱくの生体における役割を知るうえでアミロイド前駆体たんぱく(App)遺伝子変異マウスは有用と考えられるので、App変異マウス系統を樹立するためにマウス未分化胚幹細胞株を用いた標的遺伝子組換え実験を行なった。APP695をコードするmRNAを構成する16のエキソンのうち第9エキソンをふくむ遺伝子クローンを単離し、これとネオマイシン耐性発現プラスミドpMC1neoを用い、第9エキソンに約1kbの外来DNAの挿入変異を惹起する標的用ベクターを作製して、マウス未分化胚幹細胞株CB1-4に電気穿孔法にて導入した。選択培地中でコロニーを形成する細胞を、(1)継代時の生着率を高く保つために約3コロニーずつプールして混合培養した群と、(2)培養期間を最小限にとどめるよう直ちに単コロニーからの培養をはじめた群につき、PCR法およびSouthern法によって挿入変異の有無を確認した。(1)プールして混合培養した576プール(約1728コロニー)について、43プールに標的遺伝子組換えを検出した。標的組換えの相対頻度は、43/1728=1/40と算定された。6プールから限界希釈して得た胚幹細胞3クローンについて、挿入変異を確認した後CD-1マウスとのキメラ作製に用いたが、変異を子孫に伝えるような生殖系列キメラは得られなかった。(2)単コロニーからの培養群から203株を分離したが、このなかには標的組換えを検出できなかった。以上、アミロイド前駆体たんぱく遺伝子第9エキソンにおいて、標的遺伝子組換えの相対頻度が1/40と比較的効率のよい標的用ベクターを作製することができた。これを用いて、現在さらに未分化胚幹細胞の変異細胞株からアミロイド前駆体たんぱく遺伝子の変異マウス系統の樹立を試みている。

ア ミ ロ イ ド 駆 body before た ん ぱ く の raw body に お け cut を る service know る う え で ア ミ ロ イ ド 駆 body before た ん ぱ く (App) heritage 伝 sub - different マ ウ ス は useful と exam え ら れ る の で, App - different マ ウ を ス system set up す る た め に マ ウ ス undifferentiated embryonic stem cell lines を with い た mark heritage 伝 subgroups in え be 験 を line な っ た. APP695 を コ ー ド す る mRNA を constitute す る 16 の エ キ ソ ン の う ち 9 エ キ ソ ン を ふ く む posthumous son 伝 ク ロ ー ン を 単 し, こ れ と ネ オ マ イ シ ン patience 発 now プ ラ ス ミ ド pMC1neo を い, 9 エ キ ソ ン に about 1 KB の foreign DNA の scions into - different を provoked す る mark with ベ ク タ ー し を as a system Youdaoplaceholder0 and ウス undifferentiated embryonic stem cell line CB1-4に electrical perforation method にて introduction た. Sentaku in petty で コ ロ ニ ー を form す を る cells, the production rate (1) when 継 generation の を high く keep つ た め に about 3 コ ロ ニ ー ず つ プ ー ル し て mixed culture し と た group, (2) training during を minimum に と ど め る よ う straight ち に 単 コ ロ ニ ー か ら の cultivate を は じ め た group に つ き, PCR method お よ び Southern method に よ っ て Insert the change signal to check if there is を to confirm that there is た. (1) プ ー ル し て mixed culture し た 576 プ ー ル (about 1728 コ ロ ニ ー) に つ い て, 43 プ ー ル に mark heritage 伝 subgroups in え を 検 out し た. The target group is replaced by え え corresponding frequency え and 43/1728=1/40と to determine された. 6 プ ー ル か ら limit when 釈 し て have た embryo stem cell 3 ク ロ ー ン に つ い て, scions into - different を confirm し た CD - 1 マ ウ ス と の キ メ ラ for making に い た が, children - different を に 伝 え る よ う な reproductive series キ メ ラ は have ら れ な か っ た. (2) 単 コ ロ ニ ー か ら の training group of か ら 203 strains を separation し た が, こ の な か に は target group in え を 検 out で き な か っ た. Above, ア ミ ロ イ ド 駆 body before た ん ぱ く heritage 伝 son 9 エ キ ソ ン に お い て heritage, mark 伝 subgroups in え の phase frequency が seaborne 1/40 と services rate の よ い mark with ベ ク タ ー を cropping す る こ と が で き た. こ れ を with い て, now さ ら に の undifferentiated embryonic stem cells - different cell lines か ら ア ミ ロ イ ド 駆 body before た ん ぱ く posthumous son 伝 の - different マ ウ の ス system set up を try み て い る.