ジーントラップ法による未分化胚幹細胞の血液幹細胞への分化関連遺伝子の解析

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ジーントラップ法を用いて、ES細胞分化に関連する未知遺伝子の単離を試みた。En-2イントロンの下流にスプライシング受容シグナル、IRESシグナル及びLacZを配置、その後pBR322ベクタープラスミドを結合、下流にはアクチンプロモーター及びネオマイシン耐性遺伝子を挿入し、ベクターを完成させた。ES細胞株D3及びE14-1にベクターを電気穿孔法により導入し、ネオマイシン耐性コロニー約4、000個を選別した。選別クローンを分化誘導因子であるレチノイン酸下で48時間培養後X-gal染色を行ない強陽性のクローンを選別、5'RACE法を用いてRNAよりcDNAを同定し、未知のクローンに対する全長cDNAをD3細胞株より得たcDNAライブラリーから同定、塩基配列を決定した。うち1つはbZIPモチーフを有する未知の転写因子であることが判明した。一方、別の系としてクローンをC57/BL6マウスの大腿骨髄から得た線維芽細胞上にて10日間培養後X-gal染色を行った。陽性細胞を選別後、それぞれのcDNAライブラリーを作製しクローンを同定、現在10種類のcDNAの塩基配列を解析中である。さらに、ES細胞を血球系細胞へ分化させる系として、op/opマウス骨髄線維芽細胞株OP-9を支持細胞としてES細胞を分化させ得ることが報告されており、現在このシステム上でX-gal染色陽性になるクローンの選別を行なっている。