HIV中和主要ドメインV_3領域のエスケープ変異株形成機序の研究

[研究目的]HIV‐1のgp120のV_3ループは主要中和ドメイン(Principal Neutra‐lizing Determinant;PND)として、この部位に対する抗体はウイルスを良く中和する。我々は、HIV‐1_<MN>株を抗原としてV_3ループの先端部分のアミノ酸配列GPGRを認識するモノクローナル抗体(NM‐01)の作成に成功した。この抗体の存在下でHIVを継代培養して、NM‐01抵抗性エスケープ変異株を試験管内で得る事に依りHIVが感染宿主の体内で、抵抗性の変異株を形成する機構の解明を試みた。[結果と考察]I.HIV‐1分離株の再クローニング:現有のMN株とIIIB株とを用いてTCID_<50>以下に希釈しMOI:0.01以下で感染させ各ウイルスを得、クローン化した各ウイルスを得これを原株とした。II.各原株のモノクローナル抗体に対する反応性の確認:V_3領域に対する各種抗体(NM01,NM03)のエピトープ解析とクローン化原ウイルスの抗体感受性を確認した。III.特異抗体存在下でのHIVウイルスの継代培養:HIV‐1 IIIB原株ウイルスを50〜90%中和する濃度のNM‐01抗体の存在下で継代培養を実施する。3〜4日目毎に継代し、16日毎に新たな抗体を添加した。各12日毎に培養上清の逆転写酵素活性測定とウイルスの中和試験を実施した。その結果実験開始から40日頃より抗体抵抗性のウイルスの出現が観察され始めた。85日目には独立した6種類の系のうち5種類の系においてNM‐01抗体抵抗性の変異株の分離に成功した。IV.エスケープ変異株のV_3ループDNA塩基配列の解析:各種エスケープ変異株を分離してDNAを分離しPCR法によりV_3ループを含むDNA塩基配列を特異的に増幅しBluescriptでクローニングしてその塩基配列を決定した。その結果、検討した総てのクローンで319番目のアミノ酸のfirst codonのGがAに一塩基置換していることを証明した。この結果、分離した総てのエスケープ変異ウイルスは319番目のアミノ酸がAlaからThrに変化することに依ってNM‐01抗体に対する抵抗性を獲得していると推定された。

[研究目的]HIV‐1のgp120のV_3ループは主要中和ドメイン(Principal Neutra‐lizing Determinant;PND)として、この部位に対する抗体はウイルスを良く中和する。我々は、HIV‐1_<MN>株を抗原としてV_3ループの先端部分のアミノ酸配列GPGRを認識するモノクローナル抗体(NM‐01)の作成に成功した。この抗体の存在下でHIVを継代培養して、NM‐01抵抗性エスケープ変異株を試験管内で得る事に依りHIVが感染宿主の体内で、抵抗性の変異株を形成する機構の解明を試みた。[結果と考察]I.HIV‐1分離株の再クローニング:現有のMN株とIIIB株とを用いてTCID_<50>以下に希釈しMOI:0.01以下で感染させ各ウイルスを得、クローン化した各ウイルスを得これを原株とした。II.各原株のモノクローナル抗体に対する反応性の確認:V_3領域に対する各種抗体(NM01,NM03)のエピトープ解析とクローン化原ウイルスの抗体感受性を確認した。III.特異抗体存在下でのHIVウイルスの継代培養:HIV‐1 IIIB原株ウイルスを50〜90%中和する濃度のNM‐01抗体の存在下で継代培養を実施する。3〜4日目毎に継代し、16日毎に新たな抗体を添加した。各12日毎に培養上清の逆転写酵素活性測定とウイルスの中和試験を実施した。その結果実験開始から40日頃より抗体抵抗性のウイルスの出現が観察され始めた。85日目には独立した6種類の系のうち5種類の系においてNM‐01抗体抵抗性の変異株の分離に成功した。IV.エスケープ変異株のV_3ループDNA塩基配列の解析:各種エスケープ変異株を分離してDNAを分離しPCR法によりV_3ループを含むDNA塩基配列を特異的に増幅しBluescriptでクローニングしてその塩基配列を決定した。その結果、検討した総てのクローンで319番目のアミノ酸のfirst codonのGがAに一塩基置換していることを証明した。この結果、分離した総てのエスケープ変異ウイルスは319番目のアミノ酸がAlaからThrに変化することに依ってNM‐01抗体に対する抵抗性を獲得していると推定された。