RNAファージの鋳型認識機構の進化

RNA噬菌体模板识别机制的进化

• 批准号: 60224009
• 负责人: 大野 典也
• 金额: $ 0.96万
• 依托单位: Jikei University School of Medicine
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Special Project Research
• 财政年份: 1985
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1985 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-60224009/
• 关键词: Qβレプリカーゼ; 鋳型特異性; RNAファージMX-1

〔研究目的〕 RNAファージ感染菌中のレプリカーゼ(RNA依存RNA合成酵素)は、高い鋳型特異性を有するRNA合成酵素である。この酵素蛋白とRNA分子との相互認識の機構の解明は単にRNAファージの発生と進化の理解に役立つのみでなく、普遍的な核酸と蛋白質との相互識別の機構の理解さらには生命体の持つ分子認識機構の理解のためにも極めて重要な問題である。〔研究成果〕(1)Qβレプリカーゼの分離、50gのRNAQβの感染菌に(-80℃凍結保存)と100gのアルミナを徐々に加えながら菌を破砕する。これに300mlの緩衝液を加えて懸濁液としてこれを10,000rpm10分間遠心する。沈査に50%polyethylen glycolと30%(w/w)Dextran 500を加えて30分間撹拌する。これを遠心してDextran層を集める。これをNaClを含む緩衝液に溶す。さらにPolyethylen glycolを加えて、のち遠心する。Polyethylenglycol層にレプリカーゼは分画されて来る。これを透析したのち55%飽和硫安を加える。遠心して沈査を集めこれをカラムクロマトの原材料とする。2.フォスフォ・セルロース・カラム(PC) フォスフォ・セルロース・カラムにphase分配によって得られた試料をのせ50mM-1M NaClの濃度勾配によって溶出する。酵素活性をAssayして活性分画を集める。3.QAESephadexクロマトグラフ PCカラムよりの活性分画をQAE Sephadexカラムにのせ100mM AmS-300mM AmSの直線濃度勾配によって溶出する。4.アガロース・ゲル濾過 Bio Gel A0.5mカラムによってゲル濾過することによってきわめて高い比活性のQβレプリカーゼ 分離に成功した。 (2)Mx-1レプリカーゼの分離、Mx-1レプリカーゼ分離の為の第一段階として目下各種の分離条件を検討中である。Qβに於いて成功した方法についてまず試みるべく目下その準備を進めている。

[Objective] RNA dependent RNA synthase (RNA-dependent RNA synthase) in RNA infected bacteria is highly specific. The understanding of the mechanisms for mutual recognition of enzymes, proteins and RNA molecules is an important issue in understanding the development and evolution of RNA molecules, in understanding the mechanisms for mutual recognition of universal nucleic acids and proteins, and in understanding the mechanisms for molecular recognition of living organisms. [Research results](1) Isolation of Qβ RNA, 50g of Q β RNA (frozen at-80℃) and 100g of Q β RNA (frozen at-80℃). 300ml of buffer solution was added to the suspension at 10,000 rpm for 10 minutes. 50% polyethylen glycol and 30%(w/w)Dextran 500 were added and stirred for 30 minutes. The distance between the two layers of Dextran is very small. This solution contains sodium chloride. Polythylen glycol is added to the solution. Polyethylene glycol layer is divided into two layers. 55% saturated sulfur Remote inspection of raw materials 2. Phase separation and dissolution of the sample at 50mM-1M NaCl concentration. Enzyme Activity Assay 3. The activity profile of QAE Sephadex was determined by linear concentration matching between 100mM AmS and 300mM AmS. 4. Bio Gel A0.5m filter and Qβ filter were successfully separated. (2) The separation of Mx-1, Mx-1 and Mx-1 is the first stage of separation. Qβ for success in the method of test, test, test and preparation