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大腸菌ATP依存性プロテアーゼLonの構造と機能

大肠杆菌ATP依赖性蛋白酶Lon的结构和功能

基本信息

批准号：
05268211
负责人：
高橋健治
金额：
$ 1.92万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-05268211/
关键词：
大腸菌 ATP依存プロテアーゼプロテアーゼ ATPアーゼ

项目摘要

ATP依存性プロテアーゼはタンパク質分解の際ATPを加水分解するユニークなプロテアーゼ群で,細胞内の異常タンパク質の分解にかかわっている.申請者はこの中で最も単純な分子構成を持つ大腸菌のプロテアーゼLon(プロテアーゼLa)に着目し,その構造機能相関の研究をおこなっている.今年度は以下の結果を得た.1)プロテアーゼLonの大量発現・精製系の確立 T7 RNA polymeraseを用いた大量生産系を作成し,phosphocellulose,Sephacryl S-300の2本のカラムクロマトグラフィーによる簡便な精製系を確立した.これを用いれば,短期間(4日以内)に大量の完全精製標品(1lの培養液より約10mg)を得ることができる.また,精製過程および保存溶液中に30%グリセロールを添加することによりこの酵素の安定性を向上させることができることを見いだした.短期間に高純度までに精製することとグリセロールの添加により精製標品の安定性は飛躍的に向上した.従来の報告では4℃の保存において精製標品は1日で30〜40%失活するとされていたが,申請者の精製標品は同一条件下2ヶ月間経過しても活性の低下は全くみられなかった.2)プロテアーゼLonの分子量申請者が精製した標品はゲル濾過のカラムを用いたカラムクロマトグラフィーでは1,000,000程度(以上)の分子量に相当する位置に溶出した.また,この電子顕微鏡写真を撮影すると,18×25nmの大きさの一様な形で観察され,分子量は1,500,000程度であることが予測された.これらは,プロテアーゼLonは分子量87,000の同一のサブユニットからなる4量体(分子量は360,000)であるという従来の報告と異なっている.超遠心法による分子量測定などを行い,さらに検討を進める必要がある.3)X線結晶構造解析へ向けての結晶化の試み現在までに,約1000通りの条件を試みており,球晶を得ている.さらに条件検討を進めて単結晶を得,構造解析を行う予定である.これが成功すればATP依存性プロテアーゼの中では構造が決定された初めてのものとなる.

ATP dependent degradation occurs when ATP is hydrolyzed, and abnormal degradation occurs in cells. The applicant is interested in the purest molecular composition of E. coli and its related research on structure and function. This year, the following results were obtained: 1) Establishment of a mass production and purification system for T7 RNA polymerase using phosphocellulose,Sephacryl S-300 and 2 basic purification systems were established. In short term (within 4 days), a large amount of completely purified standard (1l of culture medium, about 10mg) was obtained. 30% of the enzyme stability in the purification process In the short term, high purity products are refined, and the stability of refined standards is improved. Refined standard samples stored at 4℃ for 1 day were inactivated by 30 ~ 40%. Refined standard samples of applicants were inactivated for 2 months under the same conditions. Refined standard samples of applicants were inactivated by 30 ~ 40%. Refined standard samples of applicants were inactivated by 1,000%. 000 degree (above) and molecular weight equivalent to the position of dissolution. The electron microscope images of these particles were obtained by scanning a sample size of 18 ×25nm and a molecular weight of about 1,500,000 nm. The molecular weight of 87,000 is the same as that of 4,000 molecules (molecular weight 360,000). The molecular weight determination of ultra-telecentric method is carried out in the middle of the process, and the necessary progress is made. 3) X-ray crystal structure analysis is carried out in the crystallization process. Now, about 1000 channels of conditions are tried, and the spherulites are obtained. The conditions are discussed, the crystallization is obtained, and the structural analysis is performed. The success of the ATP dependency is determined by the structure of the initial stage.