课题基金 / 基金详情

生細胞における蛋白質分解過程の可視化解析

生細胞における蛋白質分解過程の可視化解析
活细胞中蛋白质降解过程的可视化分析
批准号：
10878130
负责人：
高橋 健治
金额：
$1.22万
依托单位：
Tokyo University of Pharmacy and Life Science
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1998
资助国家：
日本
项目状态：
已结题
起止时间：
1998 至 2000
来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10878130/
关键词：
細胞内プロテオリシス可視化解析二重蛍光基質FRET海馬スライス培養カスパーゼ1細胞死グルタミン酸刺激蛍光基質アクリロダン標識基質細胞内注入コラゲナーゼカスパーゼ二重蛍光標識基質細胞内プロテアーゼFRET(蛍光共鳴エネルギー転移)CAAXモチーフ特異的プロテアーゼ

项目摘要

项目成果

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中文摘要
翻译
細胞内プロテアーゼの一つであるカスパーゼ1は細胞死におけるシグナル伝達で重要な役割を担うとされ、また基質特異性や活性発現の時期等が厳密に制御されている.本研究ではこのプロテアーゼをモデル酵素に送び.細胞内プロテオリシスの可現化解析を試みた.まず.可視化用蛍光基質をデザイン,調製した.すなわち、ペプチドYVADAPCのN末端アミノ基にテトラメチルローダミン,C末端システインのSH基にアクリロダンを導入した二重蛍光基質を合成し.DA間の切断により蛍光スペクトルの変化と増大が起こることを確認し.これがFRET(蛍光共鳴エネルギー移動)によるものであることを示した.次いで,本基質をグルタミン酸で刺激したラット脳・海馬スライス培養を用いたカスパーゼ1活性の可視化に有効であることを示した。すなわち、ラット海馬スライス培養に10mMグルタミン酸を1時間添加することで細胞死を誘導し,測定1時間前に本蛍光基質を加え.経時的に蛍光を観察したところ.CA1およびCA3領域において活性が経時的に上昇し、5〜7.5時間で最大になることが確認された,この結果は,海馬の細胞死においてカスパーゼ1が何らかの関与をしていることを示唆するものである.また,本方法はマイクロインジェクション等の特別な手法を用いなくても蛍光基質が試料表面に添加するだけで細胞内に導入されるものであり、細胞抽出物では測定できないレベルの微少の活性を検知できる事,また細胞組織を破壊せずに比較的インタクトな状態で細胞内プロテアーゼ活性を検出できるという点で優れており、応用範囲が広いものと考えられる.
英文摘要
細胞内プロテアーゼの一つであるカスパーゼ1は細胞死におけるシグナル伝達で重要な役割を担うとされ、また基質特異性や活性発現の時期等が厳密に制御されている.本研究ではこのプロテアーゼをモデル酵素に送び.細胞内プロテオリシスの可現化解析を試みた.まず.可視化用蛍光基質をデザイン,調製した.すなわち、ペプチドYVADAPCのN末端アミノ基にテトラメチルローダミン,C末端システインのSH基にアクリロダンを導入した二重蛍光基質を合成し.DA間の切断により蛍光スペクトルの変化と増大が起こることを確認し.これがFRET(蛍光共鳴エネルギー移動)によるものであることを示した.次いで,本基質をグルタミン酸で刺激したラット脳・海馬スライス培養を用いたカスパーゼ1活性の可視化に有効であることを示した。すなわち、ラット海馬スライス培養に10mMグルタミン酸を1時間添加することで細胞死を誘導し,測定1時間前に本蛍光基質を加え.経時的に蛍光を観察したところ.CA1およびCA3領域において活性が経時的に上昇し、5〜7.5時間で最大になることが確認された,この結果は,海馬の細胞死においてカスパーゼ1が何らかの関与をしていることを示唆するものである.また,本方法はマイクロインジェクション等の特別な手法を用いなくても蛍光基質が試料表面に添加するだけで細胞内に導入されるものであり、細胞抽出物では測定できないレベルの微少の活性を検知できる事,また細胞組織を破壊せずに比較的インタクトな状態で細胞内プロテアーゼ活性を検出できるという点で優れており、応用範囲が広いものと考えられる.
期刊论文(6)
专著(0)
科研奖励(0)
会议论文
Masaki Kojima: "Structure-Function Relationship of Ribonuclease T_1 Based on Molecular Structure"Bioimages. 8. 45-55 (2000)
小岛正树：“基于分子结构的核糖核酸酶 T_1 的结构功能关系”生物图像。
DOI： --
发表时间：
期刊：
影响因子： --
作者： []
通讯作者：
Atsushi Kimura: "Identification of Porcine Follipsin as Plasma Kallikrein, and Its Possible Involvement in the Production of Bradykinin within the Follicles of Porcine Ovaries"Molecular Reproduction and Development. 57. 79-87 (2000)
Atsushi Kimura：“将猪卵泡素鉴定为血浆激肽释放酶，及其可能参与猪卵巢卵泡内缓激肽的产生”分子繁殖和发育。
DOI： --
发表时间：
期刊：
影响因子： --
作者： []
通讯作者：
Tomofumi Fujino: "Indentification of the Cleavage Sites of Oxidized Protein That Are Susceptible to Oxidized Protein Hydrolase (OPH) in the Primary and Tertiary Structures of the Pretein"Journal of Biochemistry. 127. 1087-1093 (2000)
Tomofumi Fujino：“鉴定蛋白质一级和三级结构中对氧化蛋白水解酶 (OPH) 敏感的氧化蛋白切割位点”生物化学杂志。
DOI： --
发表时间：
期刊：
影响因子： --
作者： []
通讯作者：
Satoshi Yonezawa: "Cathepsin E Gene in Mouse" Biomedical Research. 19. 327-334 (1998)
Satoshi Yonezawa：“小鼠组织蛋白酶E基因”生物医学研究。
DOI： --
发表时间：
期刊：
影响因子： --
作者： []
通讯作者：
共 6 条
    ACサーボモータの高速応答化のための新しいインバータ制御法の開発研究
    • 批准号：
      10J09839
    • 项目类别：
      Grant-in-Aid for JSPS Fellows
    • 资助金额：
      $0.9万
    • 财政年份：
      2010
    • 负责人：
      高橋 健治
    • 依托单位：
      Nagaoka University of Technology
    抗マラリア剤設計標的としてのヒトマラリア原虫・ヘモグロビン分解酵素の構造と触媒機構
    環境汚染物質の除去を目的としたハロゲン化炭素水素代謝酵素の蛋白工学的研究
    • 批准号：
      08255247
    • 项目类别：
      Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
    • 资助金额：
      $1.09万
    • 财政年份：
      1996
    • 负责人：
      高橋 健治
    • 依托单位：
      Tokyo University of Pharmacy and Life Science
    環境汚染物質の除去を目的としたハロゲン化炭化水素代謝酵素の蛋白工学的研究
    • 批准号：
      07263225
    • 项目类别：
      Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
    • 资助金额：
      $1.15万
    • 财政年份：
      1995
    • 负责人：
      高橋 健治
    • 依托单位：
      Tokyo University of Pharmacy and Life Science
    海外基金