環境汚染物質の除去を目的としたハロゲン化炭素水素代謝酵素の蛋白工学的研究

卤代碳氢代谢酶去除环境污染物的蛋白质工程研究

• 批准号: 08255247
• 负责人: 高橋 健治
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: Tokyo University of Pharmacy and Life Science
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08255247/
• 关键词: ハロゲン化炭化水素; 脱ハロゲン化; グルタチオンS-トランスフェラーゼ; 蛋白工学; 部位特異的変異; X線結晶構造解析; 活性部位残基; 環境汚染物質

1.本研究の一環として、大腸菌グルタチオンS-トランスフェラーゼ(以下GST)の三次元構造をX線結晶構造解析により明らかにした。この結果、全体的な構造、構造形成やグルタチオン(GSH)の結合に関与すると考えられる残基は他生物種由来のGSTと共通性があることから、同一の起源から進化した酵素であることが示された。2.α,μ,πおよびσクラスGSTで触媒機構に関与することが明らかにされているTyr残基は、一次,二次構造的には大腸菌GSTにも保存されているが、立体構造的には触媒機構に関与し難い方向を向いており、本申請者が部位特異的変異により示したこのTry残基が活性発現に関与しないという推定が支持された。また、最近昆虫由来GSTの触媒残基の一つとして提唱されているSer残基も大腸菌GSTでは一次構造上保存されてはいるものの、部位特異的変異(Ser→Ala)では活性発現に関係しない結果を得、立体構造的にも支持される結果が得られた。一方、部位特異的変異により、His106の側鎖の重要性が示唆された。X線構造解析の結果を合わせると、His106の側鎖とCys10の主鎖のN原子がGSHのチオール基の近傍に位置し、触媒機構に関与する可能性が考えられる。したがって、GSTファミリーは活性部位の構造から少くとも3つのグループに分類される可能性が示唆された。πクラスGSTの基質特異性に関与する構造を明らかにするために、部位特異的変異およびキメラ酵素の作製による検討を行った。この結果、ラットGSTP1-1のGly104をIleに置換することにより、1-クロロ-2,4-ジニトロベンゼンに対する活性を高めることができた。この残基はすでに推定した161位残基とともに104位残基が1-クロロ-2,4-ジニトロベンゼンの結合に関与することを示唆している。4.GSTの機能変換を高速進化法により行う実験系確立のために、大腸菌GST遺伝子をクロラムフェニコール耐性遺伝子と置換する研究を進めた。

Part 1. This study の と し て, coliform グ ル タ チ オ ン S - ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ (GST) の three yuan structure を X-ray crystal structure analysis に よ り Ming ら か に し た. こ の results, all な structure, structure formation, や グ ル タ チ オ ン (GSH) の に masato and す る と exam え ら れ る residues は his biological origin の GST と convergence が あ る こ と か ら, origin of the same の か ら evolution し た enzyme で あ る こ と が shown さ れ た. 2. Alpha, mu, PI お よ び sigma ク ラ ス GST で catalytic institutions に masato and す る こ と が Ming ら か に さ れ て い る Tyr residues は, once, the secondary structure of に は coliform GST に も save さ れ て い る が, three-dimensional structure of に は catalytic institutions に masato direction and し difficult い を to い て お り, this applicant が site specific - different に よ り shown し た こ の T The が activity occurrence of ry residues is に related to the <s:1> な と う う う presumption that が supports された. ま た, recently insect origin GST の catalyst residue の a つ と し て mention sing さ れ て い る Ser residues も coliform GST で は a tectonic save さ れ て は い る も の の, site specific - different (Ser - Ala) で は active 発 now に masato is し な い results, three-dimensional structure に を も support さ れ る results ら が れ た. The specific variation of one side and part によ によ, the importance of His106 side lock が indicates された. X-ray structural analysis の result を わ せ る と, His106 の side chain と Cys10 の master lock の N atom が GSH の チ オ ー ル position の nearly alongside に し, catalytic institutions に masato and す る possibility が exam え ら れ る. し た が っ て, GST フ ァ ミ リ ー は active site の tectonic か ら less く と も 3 つ の グ ル ー プ に classification さ れ が る possibility in stopping さ れ た. PI ク ラ ス GST の substrate specificity に masato and す る tectonic を Ming ら か に す る た め に, site specific - different お よ び キ メ ラ enzyme の cropping に よ る 検 line for を っ た. こ の results, ラ ッ ト GSTP1-1 の Gly104 を Ile に replacement す る こ と に よ り, 1 - ク ロ ロ - 2, 4 - ジ ニ ト ロ ベ ン ゼ ン に す seaborne る high active を め る こ と が で き た. Presumption こ の residues は す で に し た 161 residues と と も に 104 residues が 1 - ク ロ ロ - 2, 4 - ジ ニ ト ロ ベ ン ゼ ン の combining に masato and す る こ と を in stopping し て い る. 4. GST の function variations in を high speed evolution method に よ り line う be 験 department establish の た め に, coliform GST but 伝 を ク ロ ラ ム フ ェ ニ コ ー ル patience heritage 伝 son と replacement す を る research into め た.

项目成果

井上英史: "グルタチオンS-トランスフェラーゼの立体構造と分子多様性" ファルマシア. (in press). (1997)

Hidetoshi Inoue：“谷胱甘肽 S-转移酶的三级结构和分子多样性”Pharmacia（出版中）。

Motohiko Nishida: "Crystallization and X-Ray Diffraction Studies of Glutathione S-Transferase from Escherichia coli" Journal of Crystal Growth. 168. 284-287 (1996)

Motohiko Nishida：“大肠杆菌谷胱甘肽 S-转移酶的结晶和 X 射线衍射研究”晶体生长杂志。