アルキル化剤による変異誘発とその抑制機構に及ぼす標的遺伝子の転写の影響

靶基因转录对烷化剂诱变的影响及其抑制机制

• 批准号: 05270203
• 负责人: 真木 寿治
• 金额: $ 1.92万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-05270203/
• 关键词: DNA構造; DNA損傷; DNA修復; 分子生物学

本研究計画では、DNA損傷の発生とその修復のプロセスに及ぼす転写の影響に焦点を絞り、特定の遺伝子を標的にしてDNA損傷の程度や修復酵素の作用が標的遺伝子の転写のレベルを変化させることによりどのようになるかを解析した。DNA損傷としてはアルキル化剤による損傷を選び、損傷や修復の程度、また標的遺伝子内での部位特異性を容易に解析する手段として、アルキル化剤により誘発される突然変異の頻度と標的遺伝子内での変異部位の決定を行なった。まず、変異解析の標的遺伝子としてrpsL遺伝子を用いて、アルキル化剤による誘発変異の標的遺伝子内での分布を検討したところ、標的遺伝子の数ケ所の特定の部位(ホットスポット)に集中してG:C→A:T変異のみが生じることを見いだした。アルキル化剤による前変異損傷O^6-アルキルグアニンを修復する酵素はこの損傷に特異的なメチルトランスフェラーゼであるが、この酵素を持つ細胞と持たない細胞での誘発変異の分布を比較した結果、両者で差は認められなかった。従って、変異のホットスポットは修復酵素の部位特異性に原因があるわけではないと結論された。その代わりに、上記のホットスポットは転写開始点に近いほど強いことから、標的遺伝子の転写がDNAのアルキル化に直接何らかの影響を与えていることが考えられた。次に、変異解析の標的遺伝子であるrpsL遺伝子をlacプロモーターの下流にクローン化したプラスミドを作製した。このプラスミドをada ogf株に導入し、IPTGの濃度が異なる培地中で増殖させ、アルキル化剤処理を行ない、アルキル化剤によりrpsL遺伝子に変異を生じたプラスミドを多数分離し、DNA塩基配列決定により変異部位を同定した。その結果、ホットスポットの強度は転写の程度により変化すること、その原因はアルキル化損傷の修復に加えて、転写そのものによるDNAの構造変化がアルキル化剤に対する塩基の損傷の受けやすさを変化させることにあることが判明した。

This study aims to analyze the origin and repair of DNA damage and the effects of DNA damage on gene expression, the extent of DNA damage and the role of repair enzymes. DNA damage is easy to analyze by means of damage selection, damage repair, site-specificity within the target gene, and frequency of sudden changes in the target gene. The distribution of the target gene in the target gene is discussed. The number of target genes is concentrated in specific parts of the target gene. G:C→A:T. The distribution of induced differences in cells and cells was compared between the results and those of the enzymes that repaired the damage. The site-specific reasons for the differences in the repair enzymes were discussed. In addition to the above, the author also notes that there is no direct influence on the DNA of the target gene. Next, different analysis of the target gene, rpsL gene, lac, and downstream gene The introduction of IPTG into the strain, the concentration of IPTG, the propagation of IPTG in culture, the treatment of IPTG, the treatment of IPTG, the generation of IPTG, the majority of IPTG, and the determination of DNA base alignment. The results show that the intensity of DNA damage is different from the degree of DNA damage, and the cause of DNA damage is different from the degree of DNA damage.

项目成果

Sakumi,K.: "Cloning and expression of cDNA for a human enzyme that hydrolyzes 8-oxo-dGTP,a mutagenic substrate for DNA synthesis." Journal of Biological Chemistry. 268. 23524-23530 (1993)

Sakumi,K.：“水解 8-oxo-dGTP（DNA 合成的诱变底物）的人类酶 cDNA 的克隆和表达。”

Belguise-Valladier,P.: "Effect of single DNA lesions on in vitro replication with DNA polymerase III holoenzyme." Journal of Molecular Biology. (発表予定). (1994)

Belguise-Valladier, P.：“DNA 聚合酶 III 全酶对体外复制的影响”（即将出版）。

Ito,T.: "Roles of transcription and repair in alkylation mutagenesis." Mutation Research. (発表予定). (1994)

Ito, T.：“烷基化突变研究中的转录和修复作用”（即将出版）。