分子整形技術を用いたRNAの動的構造-機能相関の研究

本研究は、極微量にしか得られないRNAの高次構造変化を追跡するために低分子RNA内部の特定部位に蛍光プローブや光で駆動される架橋性官能基等の「分子レポーター」を導入する方法を開発することを目指している。本年度得られた成果は以下の通りである。1.分子整形術による「分子レポーター」導入のモデルRNAとして酵母tRNA^<Tyr>を取り上げ、その遺伝子を大腸菌菌体内で大量発現させる系を構築することにより精製酵母tRNA標品の大量調製が可能となった。このtRNAを各種RNaseにより限定分解してD-ループ、アンチコドンループ、T-ループ内で切断されたRNA断片を効率よく調整する条件を確立した。2.RNAリガーゼ反応のドナー基質となり得る3'.5'-ヌクレオシド二リン酸体プローブモノマーとして独自にビチオン化pCpを調製し、また同様のモノマー_<ps>_4Upを東工大の関根光雄教授から提供を受け、それらをアクセプターRNA断片に連結させる反応の至適条件を検討した。3.さらに同様の目的に使用し得るプローブモノマーとしてN^6-(6-アミノヘキシル)アデノシン3'.5'-二リン酸が市販品として入手可能であることがわかったので、このヌクレオチドをまずRNAの「希望の」位置に導入しておき、RNA分子を再構築後このヌクレオチドの6-アミノヘキシル基をターゲットにFITC等の一級アミン修飾蛍光化剤で蛍光プローブを導入するルートについても検討を始めた。小スケールの予備的実験では、アンチコドンループ内の特定個所にフルオレッセイン基を持つtRNA^<Tyr>の再構築に成功している。

本研究は、極微量にしか得られないRNAの高次構造変化を追跡するために低分子RNA内部の特定部位に蛍光プローブや光で駆動される架橋性官能基等の「分子レポーター」を導入する方法を開発することを目指している。本年度得られた成果は以下の通りである。1.分子整形術による「分子レポーター」導入のモデルRNAとして酵母tRNA^<Tyr>を取り上げ、その遺伝子を大腸菌菌体内で大量発現させる系を構築することにより精製酵母tRNA標品の大量調製が可能となった。このtRNAを各種RNaseにより限定分解してD-ループ、アンチコドンループ、T-ループ内で切断されたRNA断片を効率よく調整する条件を確立した。2.RNAリガーゼ反応のドナー基質となり得る3'.5'-ヌクレオシド二リン酸体プローブモノマーとして独自にビチオン化pCpを調製し、また同様のモノマー_<ps>_4Upを東工大の関根光雄教授から提供を受け、それらをアクセプターRNA断片に連結させる反応の至適条件を検討した。3.さらに同様の目的に使用し得るプローブモノマーとしてN^6-(6-アミノヘキシル)アデノシン3'.5'-二リン酸が市販品として入手可能であることがわかったので、このヌクレオチドをまずRNAの「希望の」位置に導入しておき、RNA分子を再構築後このヌクレオチドの6-アミノヘキシル基をターゲットにFITC等の一級アミン修飾蛍光化剤で蛍光プローブを導入するルートについても検討を始めた。小スケールの予備的実験では、アンチコドンループ内の特定個所にフルオレッセイン基を持つtRNA^<Tyr>の再構築に成功している。