分子整形技術を用いたRNAの動的機能-構造相関の研究

利用分子整形技术研究RNA动态功能结构关系

基本信息

批准号：
10174214
负责人：
西川一八
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Gifu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10174214/
关键词：
蛍光プローブ分子整形技術 RNA構造-機能相関 tRNA高次構造

项目摘要

本研究は、極微量のRNAの高次構造変化を追跡するためにRNAの特定部位に蛍光プローブや光化学反応性官能基等の「分子レポーター」を導入する方法の開発を目指している。今年度の成果は以下の通りである。 (1)分子整形術による「分子レポーター」導入のモデルRNAとして酵母tRNA^<Tyr>,tRNA^<Ile>およびtRNA^<Ala>を取り上げ、これらのtRNAを適切な「保護DNA断片」共存下に酵素で限定分解することによりD-ループ、アンチコドンループ、T-ループ内でそれぞれ切断されたRNA断片を効率よく調製する条件を確立した。 (2)RNAリガーゼ反応のドナー基質となり得るプローブ単量体として、独自にフルオレセイン化pCpやフルオレセイン化N^6-(6-アミノヘキシル)pAp等の調製法を開発し、また同様のモノマーps^4Upを東工大の関根光雄助教授から提供を受け、それらをアクセプターRNA断片に連結させる反応の至適条件を検討した。 (3)上記1.および2.の組み合わせにより、分子内の各所にフルオレセイン標識ヌクレオチドを組み込んだtRNAを各種作製した。 (4)フルオレセインで蛍光標識されたtRNAとタンパク質合成諸因子(ペプチド鎖伸長因子EF-Tuなど)との相互作用を蛍光偏光解消法を用いて測定するための基礎的研究を行った。アンチコドンループ2文字目をフルオレセイン化したtRNA^<Ala>をアラニル-tRNA合成酵素によりアミノアシル化し、さらにそれがEF-TuおよびGTPと三重複合体を形成する過程を蛍光偏光解消法により追跡することに成功した。今後この系を利用して、各種変異tRNAとタンパク質合成諸因子との相互作用を定量的に解析したい。

这项研究旨在开发一种引入“分子记者”的方法，例如RNA中特定位点的荧光探针和光化学反应官能团，以跟踪极少量的RNA的构象变化。 The results for this year are as follows: (1) We took up the yeast tRNA^<Tyr>, tRNA^<Ile> and tRNA^<Ala> as model RNAs for the introduction of "molecular reporters" through molecular orthopaedic surgery, and by decomposing these tRNAs with enzymes in the presence of appropriate "protected DNA fragments", conditions were established to efficiently prepare RNA fragments cleaved in the D环，反火登环和T环。（2）我们开发了一种独特的方法，用于准备荧光PCP和以荧光感知的N^6-（6-氨基己基）为探针单体，可以作为RNA连接酶反应的供体底物，并且还提供了相似的单体PS^4UUP，由助理教授由seko nipers secky of The The The The The The The The The The The Recestors与The Incordors的助理教授进行了反应。 RNA片段。（3）通过在上方结合1和2。产生分子中各个位置的荧光素标记的核苷酸的各种TRNA。（4）使用荧光去极化进行了基础研究，以测量荧光素标记的tRNA与蛋白质合成因子（例如肽链扩展因子EF-TU）之间的相互作用。在反密码子环的第二个字母中已荧光的tRNA^<ALA>用氨基烷基-TRNA合酶氨基酰化，并通过荧光去极化成功跟踪了与EF-TU和GTP的三重复合物的过程。将来，我们希望使用该系统定量分析各种突变型TRNA与各种蛋白质合成因子之间的相互作用。