大腸菌機能未知GTP結合タンパク質の構造・機能相関

ゲノム情報が蓄積するに従って、バクテリアの遺伝子の中には、高度に保存されていながら機能が不明のGTP結合タンパク質遺伝子群が存在していることが明らかとなってきた。これらの機能を明らかにする目的で、大腸菌のERA,mnmE,lepA,yihA,ychF,yhbZとengAの各遺伝子を発現ベクターpET21aにクローニングした。このうちMnmEタンパク質をHis-tag融合タンパク質として発現させた。MnmEタンパク質はtRNAのアンチコドン1文字目の修節への関与が示唆されているが、その詳細は不明である。そこで、同じ修飾への関与が示唆されているGidAタンパク質との相互作用をnativeアガロースゲル電気泳動により観察したところ、両者が複合体を形成することが明らかとなった。今後、tRNAとの相互作用が見られるかどうかを解析していく予定である。また、タンパク質相互作用を検出する一手法として、His-tag融合MnmEタンパク質をNi-NTAアガロースに結合させ、これをMnmE固定化樹脂に早立てたアフィニティーカラムクロマトグラフィーにより、樹脂に吸着するタンパク質群を大腸菌細胞抽出液から回収した。これらについては、ペプチドマスフィンガープリント法によりタンパク質を同定した。現在、同定されたタンパク質とMnmEが実際に相互作用するかどうかを検定している。また同様の実験を他のGTP結合タンパク質についても行うことで、これら機能未知GTP結合タンパク質の機能に迫りたいと考えている。

ゲノム情報が蓄積するに従って、バクテリアの遺伝子の中には、高度に保存されていながら機能が不明のGTP結合タンパク質遺伝子群が存在していることが明らかとなってきた。これらの機能を明らかにする目的で、大腸菌のERA,mnmE,lepA,yihA,ychF,yhbZとengAの各遺伝子を発現ベクターpET21aにクローニングした。このうちMnmEタンパク質をHis-tag融合タンパク質として発現させた。MnmEタンパク質はtRNAのアンチコドン1文字目の修節への関与が示唆されているが、その詳細は不明である。そこで、同じ修飾への関与が示唆されているGidAタンパク質との相互作用をnativeアガロースゲル電気泳動により観察したところ、両者が複合体を形成することが明らかとなった。今後、tRNAとの相互作用が見られるかどうかを解析していく予定である。また、タンパク質相互作用を検出する一手法として、His-tag融合MnmEタンパク質をNi-NTAアガロースに結合させ、これをMnmE固定化樹脂に早立てたアフィニティーカラムクロマトグラフィーにより、樹脂に吸着するタンパク質群を大腸菌細胞抽出液から回収した。これらについては、ペプチドマスフィンガープリント法によりタンパク質を同定した。現在、同定されたタンパク質とMnmEが実際に相互作用するかどうかを検定している。また同様の実験を他のGTP結合タンパク質についても行うことで、これら機能未知GTP結合タンパク質の機能に迫りたいと考えている。