大腸菌機能未知GTP結合タンパク質の構造・機能相関

細胞内シグナル伝達にはGTP結合タンパク質が重要な役割を果たしている。比較的細胞機能が単純だと考えられる原核細胞内にも高度に保存されていながら未だ機能が不明なGTP結合タンパク質遺伝子群が存在することが明らかになってきたが、特に大腸菌の場合のこれらのタンパク質に注目し機能解析を行うのが本研究の目的である。今年度は、具体的には大腸菌のGTP結合タンパク質と想定される遺伝子(era, mnmE, lepA, yihA, yhbZ, engA)を発現ベクターpET21aに組み込み、C末端His-tag融合型タンパク質として大量発現させた。Ni-NTAアガロース樹脂を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製し、それぞれSDS-PAGEでほぼ単一バンドの標品を得ることができた。続いて、タンパク質間相互作用を検出するために、これらの精製できたHis-tag融合型GTP結合タンパク質をNi-NTAアガロース樹脂に吸着させ、これをタンパク質固定化樹脂とした第2のアフィニティークロマトグラフィーを行うことで大腸菌細胞抽出液の中に含まれる、これら固定化されたタンパク質と相互作用のあるタンパク質の捕獲を試みた。MnmE、YhbZ、YihAについては、特異的なタンパク質のバンドが検出された。そこで検出されたタンパク質を質量分析装置により同定した。もし、これらのGTP結合タンパク質がバクテリアにとって必須な機能を有しているなら、相互作用する相手分子もやはり保存性の高いタンパク質だと考えられる。しかし現在のところ、EF-Tu以外に保存性の高いタンパク質は認められなかった。EF-Tuは細胞中にたくさん含まれるため、非特異的な相互作用の可能性もあり、慎重に解析を進めている。

細胞内シグナル伝達にはGTP結合タンパク質が重要な役割を果たしている。比較的細胞機能が単純だと考えられる原核細胞内にも高度に保存されていながら未だ機能が不明なGTP結合タンパク質遺伝子群が存在することが明らかになってきたが、特に大腸菌の場合のこれらのタンパク質に注目し機能解析を行うのが本研究の目的である。今年度は、具体的には大腸菌のGTP結合タンパク質と想定される遺伝子(era, mnmE, lepA, yihA, yhbZ, engA)を発現ベクターpET21aに組み込み、C末端His-tag融合型タンパク質として大量発現させた。Ni-NTAアガロース樹脂を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製し、それぞれSDS-PAGEでほぼ単一バンドの標品を得ることができた。続いて、タンパク質間相互作用を検出するために、これらの精製できたHis-tag融合型GTP結合タンパク質をNi-NTAアガロース樹脂に吸着させ、これをタンパク質固定化樹脂とした第2のアフィニティークロマトグラフィーを行うことで大腸菌細胞抽出液の中に含まれる、これら固定化されたタンパク質と相互作用のあるタンパク質の捕獲を試みた。MnmE、YhbZ、YihAについては、特異的なタンパク質のバンドが検出された。そこで検出されたタンパク質を質量分析装置により同定した。もし、これらのGTP結合タンパク質がバクテリアにとって必須な機能を有しているなら、相互作用する相手分子もやはり保存性の高いタンパク質だと考えられる。しかし現在のところ、EF-Tu以外に保存性の高いタンパク質は認められなかった。EF-Tuは細胞中にたくさん含まれるため、非特異的な相互作用の可能性もあり、慎重に解析を進めている。