Entwicklung einer online-Messtechnik in Mikrotiterplatten für rekombinante Proteine mit kurzen Tags

他说：“这是一种有效的生物技术筛选方法。在Zusammenang stellen MikrotiterPlatten(MTP)中，MTP是一种新的技术。在德国的实验室里，我们正在进行大规模的扩张。这个Möglichkeiten des Mikromaüstas fficiient einzusetzen and rationale Entscheidungen Aus den vielen parparallen实验en abzuleiten，ist es unumgänglich kintische Daten Wie Biomassen-und Wertproduktkonzentation Aus den Mikrokulturen zu Erlangen.Zum Anderen被标记为verwendet，um das ZielProtein am MTP-Boden selektiv anzureichern and dot MIT fokussierender Optik zu erfassen.Verschiedene AnreicherungSprinzipien，Wie Affinität zu Nickel-Ionen Sowie Volllängenantikörpern(，AK“)to rekombinanten einzelstränGigen antikörperFragmenten(”scFv“)是eingesetzt and hisichtlich irer Selektivität and Praktikitiität verglichen。MIT einer Direcrekten and University Online-Erfassung von Bioasse-and ZielProteininkonzitzt die zu entwickelnde Technologie das潜在的过往信息与Wachstum Sowie Sowie ProteinExpression mikrobieller kulturen im^-Ma？stab zu liefern。Zukünftig soll die die Protein在未分化的地衣中表达。Dien neu gewonnenen Informationen Sollen eine Grundlage für eine Rationale and Effiziente Auswahl Geeigneter Produktionsstämme BZW.Medien schaffen.Als Biologisches ModelSystem(MikroOrganmus&ZielProtein)将在大肠杆菌gewählt中表达von Pankreskarzinom-Spezifischen einzelstränGigen rekombinanten antikörperFragmenten(ScFv)。表达和Sezernierung von kleinen Proteinen Wie ScFv在大肠杆菌中的表达-Kulturiberstand在der Gruppe Barth beabliert中的表达。如果没有标签的话，就不能用L的方法来表达，也不能用标记物标记单链抗体，也不能用固定的方法。

Die Generierung neuer Zielproteine durch die molekulare Biotechnologie hat zu einem riesigen Bedarf an effizienten und hochdurchsatzfähigen Screening-Verfahren geführt. In diesem Zusammenhang stellen Mikrotiterplatten (MTPs) einen hervorragenden Mikrobioreaktorarray zur Kultivierung von Mikroorganismen aller Art dar. Mittlerweile sind durch die verfahrenstechnische Charakterisierung vieler Mikroreaktorsysteme die Grundlagen für das Scale-Up in den herkömmlichen Labormaßstab gelegt. Um die Möglichkeiten des Mikromaßstabs effizient einzusetzen und rationale Entscheidungen aus den vielen parallelen Experimenten abzuleiten, ist es unumgänglich kinetische Daten wie Biomassen- und Wertproduktkonzentration aus den Mikrokulturen zu erlangen. Als Ausgangspunkt für das Forschungsvorhaben dient die am Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik entwickelte Technologie zur optischen, nicht invasiven online-Verfolgung von geschüttelten mikrobiellen Kulturen. Diese Technologie ermöglicht neben der Messung der Biomasse die Konzentrationsmessung des Wertproduktes (im Folgenden: „Zielproteins"), welches mit GFP (Grün Fluoreszierendes Protein) fusioniert wird. Allerdings ist die Fusion eines Zielproteins mit GFP in sehr vielen Fällen nicht möglich.Mit diesem Projekt soll ein universeller optischer online Nachweis von Zielproteinen ohne Fusion mit GFP ermöglicht werden. Zu diesem Zweck sollen sezernierte Proteine mit Hilfe kurzer Tags (in der Größenordnung eines His-Tag) an den Mikroreaktorboden gebunden und dort delektiert werden. Zum einen werden zur Zielprotein-Erfassung optisch aktive Tags verwendet, welche fluoreszierende Aminosäuren, wie Tryptophan und Tyrosin enthalten (im Folgenden „PolyTrp-Tag"). Dabei soll erstmals untersucht werden, wie selektiv die Fluoreszenz eines solchen Tags (in Abhängigkeit von seiner Zusammensetzung) gegenüber dem Flüssigkeitshintergrund detektiert werden kann. Zum anderen werden die Tags verwendet, um das Zielprotein am MTP-Boden selektiv anzureichern und dort mit fokussierender Optik zu erfassen. Verschiedene Anreicherungsprinzipien, wie Affinität zu Nickel-Ionen sowie Volllängenantikörpern (,AK") oder rekombinanten einzelsträngigen Antikörperfragmenten („scFv") werden eingesetzt und hinsichtlich ihrer Selektivität und Praktikabilität verglichen. Mit einer direkten und universellen online- Erfassung von Biomasse- und Zielproteinkonzentration besitzt die zu entwickelnde Technologie das Potential erstmals wichtige Informationen über das Wachstum sowie Proteinexpression mikrobieller Kulturen im ^-Maßstab zu liefern. Zukünftig soll die Proteinexpression in unterschiedlichen Stämmen auf verschiedenen Medien hochparallel untersucht werden. Die neu gewonnenen Informationen sollen eine Grundlage für eine rationale und effiziente Auswahl geeigneter Produktionsstämme bzw. Medien schaffen.Als biologisches Modellsystem (Mikroorganismus & Zielprotein) wird die Expression von Pankreaskarzinom- spezifischen einzelsträngigen rekombinanten Antikörperfragmenten (scFv) in E. coli gewählt. Die Expression und Sezernierung von kleinen Proteinen wie scFv in den E. coli- Kulturiiberstand ist in der Gruppe Barth bereits etabliert. Damit lässt sich der Aufwand bei der Expression des Zielproteins mit unterschiedlichen Tags, aber auch entsprechender Tagspezifischer scFv, welche auf dem MTP-Boden immobilisiert werden, bewältigen.