Entwicklung einer online-Messtechnik in Mikrotiterplatten für rekombinante Proteine mit kurzen Tags

短标签重组蛋白微量滴定板在线测量技术的开发

• 批准号: 47386860
• 负责人: Professor Dr. Stefan Barth
• 金额: --
• 依托单位: Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik (BioVT)
• 依托单位国家: 德国
• 项目类别: Research Grants
• 财政年份: 2007
• 资助国家: 德国
• 起止时间: 2006-12-31 至 2011-12-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://gepris.dfg.de/gepris/projekt/47386860?language=en
• 关键词: Entwicklung; einer; online; Messtechnik; Mikrotiterplatten

Die Generierung neuer Zielproteine durch die molekulare Biotechnologie hat zu einem riesigen Bedarf an effizienten und hochdurchsatzfähigen Screening-Verfahren geführt. In diesem Zusammenhang stellen Mikrotiterplatten (MTPs) einen hervorragenden Mikrobioreaktorarray zur Kultivierung von Mikroorganismen aller Art dar. Mittlerweile sind durch die verfahrenstechnische Charakterisierung vieler Mikroreaktorsysteme die Grundlagen für das Scale-Up in den herkömmlichen Labormaßstab gelegt. Um die Möglichkeiten des Mikromaßstabs effizient einzusetzen und rationale Entscheidungen aus den vielen parallelen Experimenten abzuleiten, ist es unumgänglich kinetische Daten wie Biomassen- und Wertproduktkonzentration aus den Mikrokulturen zu erlangen. Als Ausgangspunkt für das Forschungsvorhaben dient die am Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik entwickelte Technologie zur optischen, nicht invasiven online-Verfolgung von geschüttelten mikrobiellen Kulturen. Diese Technologie ermöglicht neben der Messung der Biomasse die Konzentrationsmessung des Wertproduktes (im Folgenden: „Zielproteins"), welches mit GFP (Grün Fluoreszierendes Protein) fusioniert wird. Allerdings ist die Fusion eines Zielproteins mit GFP in sehr vielen Fällen nicht möglich.Mit diesem Projekt soll ein universeller optischer online Nachweis von Zielproteinen ohne Fusion mit GFP ermöglicht werden. Zu diesem Zweck sollen sezernierte Proteine mit Hilfe kurzer Tags (in der Größenordnung eines His-Tag) an den Mikroreaktorboden gebunden und dort delektiert werden. Zum einen werden zur Zielprotein-Erfassung optisch aktive Tags verwendet, welche fluoreszierende Aminosäuren, wie Tryptophan und Tyrosin enthalten (im Folgenden „PolyTrp-Tag"). Dabei soll erstmals untersucht werden, wie selektiv die Fluoreszenz eines solchen Tags (in Abhängigkeit von seiner Zusammensetzung) gegenüber dem Flüssigkeitshintergrund detektiert werden kann. Zum anderen werden die Tags verwendet, um das Zielprotein am MTP-Boden selektiv anzureichern und dort mit fokussierender Optik zu erfassen. Verschiedene Anreicherungsprinzipien, wie Affinität zu Nickel-Ionen sowie Volllängenantikörpern (,AK") oder rekombinanten einzelsträngigen Antikörperfragmenten („scFv") werden eingesetzt und hinsichtlich ihrer Selektivität und Praktikabilität verglichen. Mit einer direkten und universellen online- Erfassung von Biomasse- und Zielproteinkonzentration besitzt die zu entwickelnde Technologie das Potential erstmals wichtige Informationen über das Wachstum sowie Proteinexpression mikrobieller Kulturen im ^-Maßstab zu liefern. Zukünftig soll die Proteinexpression in unterschiedlichen Stämmen auf verschiedenen Medien hochparallel untersucht werden. Die neu gewonnenen Informationen sollen eine Grundlage für eine rationale und effiziente Auswahl geeigneter Produktionsstämme bzw. Medien schaffen.Als biologisches Modellsystem (Mikroorganismus & Zielprotein) wird die Expression von Pankreaskarzinom- spezifischen einzelsträngigen rekombinanten Antikörperfragmenten (scFv) in E. coli gewählt. Die Expression und Sezernierung von kleinen Proteinen wie scFv in den E. coli- Kulturiiberstand ist in der Gruppe Barth bereits etabliert. Damit lässt sich der Aufwand bei der Expression des Zielproteins mit unterschiedlichen Tags, aber auch entsprechender Tagspezifischer scFv, welche auf dem MTP-Boden immobilisiert werden, bewältigen.

通过分子生物技术生产新的Zielproteine，可以有效地提高筛选效率。在这两个微滴定板（MTPs）中，有一个微生物反应器阵列，用于阿勒艺术中培养微生物。Mittlerweile sind durch die verfaesthetechnische Charakterisierung vieler Mikroreaktorsysteme die Grundlagen für das Scale-Up in den herkömmlichen massstab gelegt.通过多个平行实验确定的微生物接种物的有效性和合理性，是埃尔兰根微生物培养物生物量和Wertproduktkonzentration的唯一动力学数据。Als Ausgangspunkt für das Forschungsvorhaben dient die am Lehrstuhl für Bioverfaucet stechnik entwickelte Technologie zur optischen，nicht invasiven online-Verfolgung von geschüttelten mikrobiellen Kulturen. Diese Technologie ermöglicht neben der Mesung der Biomasse die Konzentrationsmesung des Wertproduktes（在Folgenden：“ZielProteins”），welches mit GFP（绿色荧光蛋白）fusioniert wird。Allerdings ist die Fusion eines Zielproteins mit GFP in sehr vielen Fällen nicht möglich.Mit diesem Projekt soll ein universeller optischer online Nachweis von Zielproteinen ohne Fusion mit GFP ermöglicht韦尔登. Zu diesem Zweck sollen sezernierte Proteine mit Hilfe kurzer Tags（in der Größe dunnung eines His-Tag）and den Mikroreaktorboden gebunden und dort delektiert韦尔登. Zum einen韦尔登zur Zielprotein-Erfasung Optisch aktive Tags verwendet，welche fluoresierende Aminosäuren，wie Tryptophan und Tyrosin bridten（im Folgenden“PolyTrp-Tag”）. Dabei soll erstmals untersucht韦尔登，wie selektiv die selzenz eines solchen Tags（in Abhängigkeit von seiner Zusammensetzung）gegenüber dem Flüssigkeitshintergrund detektiert韦尔登kann.然后韦尔登贴在MTP-Boden上，使Zielprotein选择性地贴在标签上，并且不使用聚焦光学。Veronyedene Anreicherungsprinzipien，wie Affinität zu Nickel-Ionen sowie Volllängenantikörpern（，AK”）oder rekombinanten einzelsträngigen Antikörperfragmenten（"scFv”）韦尔登eingesetzt und hinsichtlich ihrer Selektivität und Praktikabilität verglichen.生物量和Zielproteinkonzentration的直接和普遍在线研究表明，该技术可用于在微生物培养物中进行蛋白质表达微生物学研究。因此，我们可以在不受干扰的环境中表达与受干扰的介质平行的韦尔登蛋白。Die neu gewonnenen Informationen sollen eine Grundlage für eine rationale und effiziente Auswahl geeigneter Produktionsstämme bzw.利用生物学模型系统（微生物和Zielprotein）在大肠杆菌中表达pankreaskarzinom-spezifischen einzelsträngigen rekombinanten Antikörperfragmenten（scFv）。大肠杆菌用单链抗体在大肠杆菌中表达和检测Kleinen蛋白。大肠杆菌--文化自由主义在巴特集团中得到了确立。在表达带有非特异性标签的Zielproteins时，可以增加表达量，但也可以加入标签特异性单链抗体，然后在MTP-Boden固定韦尔登上表达。