ヒトリンホトキシンに対する細胞膜レセプタ-の構造

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ヒトリンホトキシン(LT)レセプタ-をU937細胞粗膜画分より3つの方法により精製した。初めにLTを直線リガンドとするアフィニティクロマトグラフィ-を用いる方法、第2に抗LT抗体を用いたイムノアフィニティクロマトクラフィ-ではLT-LTレセプタ-複合体を精製する方法、第3に活性を保持したままLTをビオチン化しこれをアビジンアガロ-スに結合しアフィニティクロマトクラフィ-を用いる方法である。これらの結果、LTと特異的に結合する60Kと65Kの2つのチンパクが同定された。この2種類のタンパク質をSDS電気泳動後ゲルから抽出を行ない、それぞれ5μg程度精製を行なった。次にこの2つのタンパクが同一のものか否かを解討するためにペプチドマッピングを行なった。それぞれをエンドプロテイナ-ゼLys-Cにより37℃、一晩消化後C18を用いた逆相HPLCにかけた。これらのLys-C消化物のHPLC上での溶出パタ-ンは異なり、60Kと65Kのタンパクは異なるものであることが示唆された。また、これらのLys-Cフラグメントをそれぞれ分取しプロテインシ-クエンサ-にかけそれらのアミノ酸配列を調べたところ、いくつかのペプチドの部分アミノ酸配列が決定された。その結果、60Kと65Kのタンパクは明らかに異なるタンパクであることがわかった他に、コンピュ-タを用い他のタンパクとの相同性を調べたところ既知のタンパク質との相同性は認められなかった。60K、65Kの部分アミノ酸配列をもとにそれぞれ合成ペプチドを作成した。これらの合成ペプチドはBSAにカップリングしウサギあるいはマウスに免疫し60Kおよび65Kに対する抗体の作成を行なった。60KのタンパクはLTが結合することが明らかになっているが、65Kのタンパクの役割は一体何なのかこれらの抗体を用いて検討を行なっている。