チトクロ-ムP-450sccとその還心酵素系との反応メカニズムと結合部位の研究

副腎皮質ミトコンドリアのステロイド水酸化酵素系を構成するアドレノドキシン還元酵素(AR)、アドレノドキシン(AD)及びチトクロ-ムP-450scc(P-450scc)の反応メカニズムと構造との相関を研究するために、63年度より、ADとP-450sccのcross-linked complexを水溶性カルボジイミドを用いて調製し、その精製について試みてきた。63年度には、残念乍ら、その完全精製には至らなかった。元年度は、63年度に引き続き、その精製法について検討した。P-450scc(351nmol)とAD(1053nmol)とを10mMリン酸援衝液(pH7.4)に対して透析したのち、4mMEDCで、、0℃5時間反応させ、セファデックスG-25で過剰のEDCを除いた。w-アミノオクチルセファロ-ス4B、CM-セファデックスC-50カラムでAD-P-450sccのcross-linked complexを部分精製したのち、ハイドロキシルアパタイトのHPLCカラムでcomplexをほぼ純粋に精製することができた。得られたcovalent complexの酸化型スペクトルは、high spin型とlow spin型のmixed typeであり、精製したARとNADPHで、covalent complex中のP-450sccのへいを還元できたが、その割合は20%程度であった。covalent complexをTCA処理でアポ化したのち、システインの-SHをピリジルエチル化し、リシルエンドペプチダ-ゼでペプチドに分解し、そのcross-linked peptideの同定を試みた。この結果、cross-linked peptideは、ADのN末端のペプチド(lle-7〜Lys-22)を含んでおり、ADには、AR結合部位(Lys-66付近、63年度本研究から同定済)とP-450scc結合部位の2つのドメインを有し、本反応メカニズムが、clusterモデルでも説明できることが明らかとなった。

副腎皮質ミトコンドリアのステロイド水酸化酵素系を構成するアドレノドキシン還元酵素(AR)、アドレノドキシン(AD)及びチトクロ-ムP-450scc(P-450scc)の反応メカニズムと構造との相関を研究するために、63年度より、ADとP-450sccのcross-linked complexを水溶性カルボジイミドを用いて調製し、その精製について試みてきた。63年度には、残念乍ら、その完全精製には至らなかった。元年度は、63年度に引き続き、その精製法について検討した。P-450scc(351nmol)とAD(1053nmol)とを10mMリン酸援衝液(pH7.4)に対して透析したのち、4mMEDCで、、0℃5時間反応させ、セファデックスG-25で過剰のEDCを除いた。w-アミノオクチルセファロ-ス4B、CM-セファデックスC-50カラムでAD-P-450sccのcross-linked complexを部分精製したのち、ハイドロキシルアパタイトのHPLCカラムでcomplexをほぼ純粋に精製することができた。得られたcovalent complexの酸化型スペクトルは、high spin型とlow spin型のmixed typeであり、精製したARとNADPHで、covalent complex中のP-450sccのへいを還元できたが、その割合は20%程度であった。covalent complexをTCA処理でアポ化したのち、システインの-SHをピリジルエチル化し、リシルエンドペプチダ-ゼでペプチドに分解し、そのcross-linked peptideの同定を試みた。この結果、cross-linked peptideは、ADのN末端のペプチド(lle-7〜Lys-22)を含んでおり、ADには、AR結合部位(Lys-66付近、63年度本研究から同定済)とP-450scc結合部位の2つのドメインを有し、本反応メカニズムが、clusterモデルでも説明できることが明らかとなった。