チトクロ-ムP-450sccとその還心酵素系との反応メカニズムと結合部位の研究

细胞色素P-450scc与其还原酶系统反应机制及结合位点研究

• 批准号: 01635511
• 负责人: 原 孝之
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: Nakamura Gakuen College
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1989
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1989 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-01635511/
• 关键词: アドレノドキシン還元酵素; アドレノドキシン; チトクロ-ムP-450scc; コレステロ-ル側鎖切断反応; 酵素反応機構; 結合部位; 架橋反応; タンパク質複合体

副腎皮質ミトコンドリアのステロイド水酸化酵素系を構成するアドレノドキシン還元酵素(AR)、アドレノドキシン(AD)及びチトクロ-ムP-450scc(P-450scc)の反応メカニズムと構造との相関を研究するために、63年度より、ADとP-450sccのcross-linked complexを水溶性カルボジイミドを用いて調製し、その精製について試みてきた。63年度には、残念乍ら、その完全精製には至らなかった。元年度は、63年度に引き続き、その精製法について検討した。P-450scc(351nmol)とAD(1053nmol)とを10mMリン酸援衝液(pH7.4)に対して透析したのち、4mMEDCで、、0℃5時間反応させ、セファデックスG-25で過剰のEDCを除いた。w-アミノオクチルセファロ-ス4B、CM-セファデックスC-50カラムでAD-P-450sccのcross-linked complexを部分精製したのち、ハイドロキシルアパタイトのHPLCカラムでcomplexをほぼ純粋に精製することができた。得られたcovalent complexの酸化型スペクトルは、high spin型とlow spin型のmixed typeであり、精製したARとNADPHで、covalent complex中のP-450sccのへいを還元できたが、その割合は20%程度であった。covalent complexをTCA処理でアポ化したのち、システインの-SHをピリジルエチル化し、リシルエンドペプチダ-ゼでペプチドに分解し、そのcross-linked peptideの同定を試みた。この結果、cross-linked peptideは、ADのN末端のペプチド(lle-7〜Lys-22)を含んでおり、ADには、AR結合部位(Lys-66付近、63年度本研究から同定済)とP-450scc結合部位の2つのドメインを有し、本反応メカニズムが、clusterモデルでも説明できることが明らかとなった。

A cross-linked complex of P-450scc (P-450scc), AD and P-450scc, a water-soluble enzyme, was used to modulate and refine the enzyme system. 63 years old, the last thought, the perfect refinement. In 1963 and 1964, the company introduced a new method of refining. P-450scc(351nmol) AD(1053nmol) AD(1053nmol) AD (10mM) acid buffer solution (pH 7.4) for dialysis, 4 mM DC, 0℃5 h reaction, G-25 EDC removal. The AD-P-450scc cross-linked complex was partially refined by HPLC from the AD-P-450scc 4B, CM-P-C-50 system. Covalent complex acid type, high spin type, low spin type, mixed type, refined AR type, covalent complex P-450scc type, mixed type Covalent complex TCA treatment is a process of separation and identification of cross-linked peptide. The results showed that the cross-linked peptide, AD N-terminal region (lle-7 ~ Lys-22), AD N-terminal region (lle-7 ~ Lys-22), AR binding region (Lys-66), AR binding region (63), P-450scc binding region (2), P-450scc binding region (2), P-450scc binding region (3), AR binding region (6), AR

项目成果

Takayuki Hara and Tokuji Kimura: "Active Complex between Adrenodoxin Reductase and Adrenodoxin in the Cytochrome P-450scc Reduction Reaction" J.Biochem.105. 601-605 (1989)

Takayuki Hara 和 Tokuji Kimura：“细胞色素 P-450scc 还原反应中肾上腺素还蛋白还原酶和肾上腺素还蛋白之间的活性复合物”J.Biochem.105。

Takayuki Hara and Toshiyuki Miyata: "Purification of a Cross-Linked Coplex between Adrenodoxin and Cytochrome P-450scc and Its Identification of a Cross-linking Site" J.Biol.Chem.

Takayuki Hara 和 Toshiyuki Miyata：“肾上腺氧还蛋白和细胞色素 P-450scc 之间交联复合物的纯化及其交联位点的鉴定”J.Biol.Chem。

Takayuki Hara and Toshiyuki Miyata: "Identification of a Cross-Linked Peptide of a Covalent Complex between Adrenodoxin Reductase and Adrenodoxin" J.Biochem.

Takayuki Hara 和 Toshiyuki Miyata：“肾上腺素还蛋白还原酶和肾上腺素还素之间共价复合物的交联肽的鉴定”J.Biochem。

Takayuki Hara and Tokuji Kimura: "Purification and Catalytic Properties of a Cross-Linked Complex between Adrenodoxin Reductase and Adrenodoxin" J.Biochem.105. 594-600 (1989)

Takayuki Hara 和 Tokuji Kimura：“肾上腺素还蛋白还原酶和肾上腺素还素之间交联复合物的纯化和催化特性”J.Biochem.105。