マンノース6-燐酸非依存性のリソソーム酵素の識別機構

6-磷酸甘露糖非依赖性溶酶体酶的鉴定机制

• 批准号: 06248101
• 负责人: 今井 勝行
• 金额: $ 0.83万
• 依托单位: Shimane Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-06248101/
• 关键词: リソソーム; グルコセレブロシダーゼ; β-グルコシダーゼ; 結合蛋白質; 選別輸送

リソソームの可溶性酵素はマンノース6-燐酸受容体によって認識され、また、膜蛋白質のあるものはC末端のTyr含有ペプチドが移行シグナルとなり、リソソームへ輸送される。グルコセレブロシダーゼ/β-グルコシダーゼ(GC)はこれらいずれの機構にもよらず、第三の識別機構が存在すると考えられる。GCは生合成途中より膜結合型となり、また、糖鎖付加阻害剤ツニカマイシン存在下でも正しく選別される。そこで、今年度は膜結合に関与するGCの構造解析と結合蛋白質について検討した。GCのcDNAより、末端や内部配列を欠損した変異型を作成し、プラスミドに挿入後、cRNAを調製した。これを兎網状赤血球系で翻訳させ、対応する各種^<35>S-標識変異型GCを作成した。膜標本はHepG2細胞より得たミクロソーム画分をpH10.6-0.2%サポニンで処理したものを用いた。全長の^<35>S-GCと膜との結合はpH5.5で最大を示し、ヒト胎盤GCで阻害された。しかし、変異型GCはどれも明確なピークを示さず、また、拮抗阻害も見られなかった。これらの事実は、結合には特定の部位だけではなく、一定の三次構造も必要であることを示唆している。更に、胎盤GCを結合した膜をトリトンで可溶化し、抗GC抗体とプロテイン-Aゲルにより、GCに会合する蛋白質をSDS-PAGEで調べると、57kDaの蛋白質がpH5.5でのみ共沈した。また、膜蛋白質を可溶化後、SDS-PAGEにかけ、ニトロセルロース膜へ転移させ、全長の^<35>S-GCを用いてリガンドブロッテイングを行なうと、pH5.5で55-59kDaにバンドが出現するが、pH8では検出されなかった。これらのことから、57kDa蛋白質がGCに結合し、その選別輸送に関与している可能性が考えられ、今後、さらに追究して行きたい。

リソソームのsoluble enzyme はマンノース6-phosphonic acid acceptor によって recognition され, また, membrane protein のThe C-terminal あるものはTyr contains ペプチドがshifting シグナルとなり and リソソームへtransporting される.グルコセレブロシダーゼ/β-グルコシダーゼ(GC)はこれらいずれの Organization にもよらず、The third のidentification organization がexistent すると考えられる. During the synthesis of GC, the membrane-bound となり, また, and sugar locks are added with the blocking agent ツニカマイシン.そこで、This year's はmembrane binding and するGC's structure analysis and binding protein について検した. GC's cDNA is constructed, the internal arrangement of the terminal is damaged, the heterotype is created, and the cRNA is modulated after inserting. Various types of reticular erythrocytes are produced, such as で樳させ and 対応する^<35>S-labeled special-shaped GC. Membrane specimens of HepG2 cells were separated and treated with pH 10.6-0.2% pH 10.6-0.2% sterilized cells. Full-length の^<35>S-GC and membrane are combined, pH 5.5 is the maximum, and the placenta GC is not hindered.しかし, 変 heterogeneous GC はどれもclear なピークをshow さず, また, antagonistic resistance も见られなかった.これらの事実は, combined with にはspecific parts だけではなく, certain tertiary structure もnecessary であることをshows している. More, placenta GC を binding membrane を トリトン soluble し, anti-GC antibody とプロテイン-Aゲルにより, GC The protein was synthesized by SDS-PAGE, and the protein of 57kDa was co-precipitated with pH 5.5. After solubilization of membrane proteins, SDS-PAGE, ニトロセルロース membrane transfer, full-length の^<35>S-GC いてリガンドブロッテイングを行なうと、pH5.5で55-59 kDaにバンドがappearsするが, pH8では検出されなかった.これらのことから, 57kDa protein がGC に binding し, そのselective transport and しているpossibility がtest えられ, from now on, さらにinvestigation して行きたい.