遺伝子情報維持に関与するタンパク質カスケードの解明

ポリADP-リボース合成酵素が、DNA損傷部位に結合してから種々のタンパク質に相互作用し、細胞周期のG1もしくはG2停止を促し、その結果DNA修復がスムーズに行なわれるのではないかという作業仮説のもとに、免疫沈降法とWest-westernblotting法を用いて本酵素と相互作用するタンパク質の同定を試みた。またin vivoでポリADP-リボース合成酵素がどのように機能しているかを、ショウジョウバエで本酵素遺伝子の欠損した変異体の単離を試み、その表現形質を解析した。成果:[方法]1)ショウジョウバエポリADP-リボース合成酵素に対する抗体を作成し免疫沈降に用いた。ロイシンジッパーを含む自己修飾ドメインのGST融合タンパク質をプローブに用いて細胞粗抽出液に対するWest-western blottingとλgt11 cDNAライブラリーのスクリーニングを行なった。2)唾腺染色体を用いたin situハイブリダイゼーション法で本酵素遺伝子の染色体上の位置を同定し、すでに報告されている欠失変異体を解析した。[結果]1)ショウジョウバエKC細胞の粗抽出液を抗ショウジョウバエポリADP-リボース合成酵素抗体にて、123、116、92、77、63kDaのタンパク質が共沈した。同様にWest-western blotting法にて結合するタンパク質を検出した。West-western blotting法によるcDNAライブラリーのスクリーニングにより60万個の中から、19個のクローンを単離した。得られたクローンにコードされるタンパク質は、ポリADP-リボース合成酵素とヘテロダイマーを形成すると考えられた。2)ポリADP-リボース合成酵素は第3染色体にマップされた。同領域に欠失をもつ変異体のうち、2つの変異体が本酵素遺伝子の一部のみを欠失しており、これらのホモ接合体は成虫になることができず、発生のいずれかの段階で死ぬことが明らかになった。

ポリADP-リボース合成酵素が、DNA損傷部位に結合してから種々のタンパク質に相互作用し、細胞周期のG1もしくはG2停止を促し、その結果DNA修復がスムーズに行なわれるのではないかという作業仮説のもとに、免疫沈降法とWest-westernblotting法を用いて本酵素と相互作用するタンパク質の同定を試みた。またin vivoでポリADP-リボース合成酵素がどのように機能しているかを、ショウジョウバエで本酵素遺伝子の欠損した変異体の単離を試み、その表現形質を解析した。成果:[方法]1)ショウジョウバエポリADP-リボース合成酵素に対する抗体を作成し免疫沈降に用いた。ロイシンジッパーを含む自己修飾ドメインのGST融合タンパク質をプローブに用いて細胞粗抽出液に対するWest-western blottingとλgt11 cDNAライブラリーのスクリーニングを行なった。2)唾腺染色体を用いたin situハイブリダイゼーション法で本酵素遺伝子の染色体上の位置を同定し、すでに報告されている欠失変異体を解析した。[結果]1)ショウジョウバエKC細胞の粗抽出液を抗ショウジョウバエポリADP-リボース合成酵素抗体にて、123、116、92、77、63kDaのタンパク質が共沈した。同様にWest-western blotting法にて結合するタンパク質を検出した。West-western blotting法によるcDNAライブラリーのスクリーニングにより60万個の中から、19個のクローンを単離した。得られたクローンにコードされるタンパク質は、ポリADP-リボース合成酵素とヘテロダイマーを形成すると考えられた。2)ポリADP-リボース合成酵素は第3染色体にマップされた。同領域に欠失をもつ変異体のうち、2つの変異体が本酵素遺伝子の一部のみを欠失しており、これらのホモ接合体は成虫になることができず、発生のいずれかの段階で死ぬことが明らかになった。