真核細胞DNA複製ライセンス因子の同定とその機能の解明

研究成果:ツメガエル卵における複製ライセンス因子の同定 これまでの研究により、核形成前にS期特異的にクロマチンへ結合し、複製開始に必要な蛋白質として、出芽酵母の複製開始に必要なMCM3遺伝子産物のツメガエルホモログ(XMCM3)を同定した。抗XMCM3抗体を用いて卵抽出液成分の免疫沈殿を行った結果、XMCM3と物理的に相互作用している、5種類の蛋白質を同定した。こられの蛋白質に対する特異的抗体を用いて、それぞれの蛋白質をコードする遺伝子を単離し、そのシーケンスを決定した結果、全ての蛋白質はMCM蛋白質ファミリーに属することがわかった。また蛋白質の1次構造の比較からZnフィンガー様モチーフを持つものと持たないものがあった。ツメガエル卵での複製開始反応には、これら蛋白質の複合体が必要であり、蛍光抗体法で調べると、複製反応の進行に伴ってクロマチンから遊離するというライセンス因子様の挙動を示すことがわかった。哺乳動物細胞におけるDNA複製ライセンス因子の同定 ツメガエル卵で同定されたライセンス因子の候補と考えられるXMCM蛋白質の哺乳動物ホモログを同定するため、XMCM蛋白質のcDNAをプローブに用いてヒト培養細胞のcDNAライブラリーをスクリーニングし、3種類のヒトMCM蛋白質をコードする遺伝子をクローン化した。ヒトMCM3については、ツメガエルの抗体が特異的に交差する事を利用して、細胞周期での挙動を調べた結果DNA複製の進行に伴いクロマチンから遊離し、M期の終わりに再びクロマチンに結合するというライセンス因子様の挙動を示すことがわかった。

研究成果:ツメガエル卵における複製ライセンス因子の同定 これまでの研究により、核形成前にS期特異的にクロマチンへ結合し、複製開始に必要な蛋白質として、出芽酵母の複製開始に必要なMCM3遺伝子産物のツメガエルホモログ(XMCM3)を同定した。抗XMCM3抗体を用いて卵抽出液成分の免疫沈殿を行った結果、XMCM3と物理的に相互作用している、5種類の蛋白質を同定した。こられの蛋白質に対する特異的抗体を用いて、それぞれの蛋白質をコードする遺伝子を単離し、そのシーケンスを決定した結果、全ての蛋白質はMCM蛋白質ファミリーに属することがわかった。また蛋白質の1次構造の比較からZnフィンガー様モチーフを持つものと持たないものがあった。ツメガエル卵での複製開始反応には、これら蛋白質の複合体が必要であり、蛍光抗体法で調べると、複製反応の進行に伴ってクロマチンから遊離するというライセンス因子様の挙動を示すことがわかった。哺乳動物細胞におけるDNA複製ライセンス因子の同定 ツメガエル卵で同定されたライセンス因子の候補と考えられるXMCM蛋白質の哺乳動物ホモログを同定するため、XMCM蛋白質のcDNAをプローブに用いてヒト培養細胞のcDNAライブラリーをスクリーニングし、3種類のヒトMCM蛋白質をコードする遺伝子をクローン化した。ヒトMCM3については、ツメガエルの抗体が特異的に交差する事を利用して、細胞周期での挙動を調べた結果DNA複製の進行に伴いクロマチンから遊離し、M期の終わりに再びクロマチンに結合するというライセンス因子様の挙動を示すことがわかった。