Rasタンパク質とそれに相互作用する機能タンパク質の結合様式の解析

現在我々は、RasによるRafの活性化には膜結合型のチロシンキナーゼであるSrcが必要であると考えて実験を進めている。平成7年度は培養細胞を用いたin vivoの系によって、RasによるRafの活性化へのSrcの関与の有無について検討を行った。ヒト胎児腎細胞由来HEK293細胞において活性型Rasを発現させるとRafの活性化が観察されるが、この時に活性型Srcを共発現させるとRafの活性は相乗的に上昇することが観察された。また活性型Src単独でもRafを部分的に活性化した。この活性型SrcによるRafの活性化はRasの優性抑制型変異体(Ras[S17N])によって強く抑制された。また細胞にチロシンキナーゼの阻害剤であるハービマイシンAを作用させたところ、活性型RasによるRafの活性化が抑えられた。さらに我々は優性抑制型変異体であるRas[G12V,C186S]がRafを細胞質に捕捉することによって活性型RasによるRafの活性化を阻害してしまうことを見い出したが、この変異体は活性型SrcによるRafの活性化や活性型Rasと活性型Srcの共発現によるRafの活性化も抑制した。これらのことから、RasやSrcによるRafの活性化は細胞膜上で起き、その際RasとSrcが互いに不可欠であると思われる。現在、in vitroの系を用いて実際にRasとSrcが協同的にRafを活性化するかどうかを検討中である。

現在我々は、RasによるRafの活性化には膜結合型のチロシンキナーゼであるSrcが必要であると考えて実験を進めている。平成7年度は培養細胞を用いたin vivoの系によって、RasによるRafの活性化へのSrcの関与の有無について検討を行った。ヒト胎児腎細胞由来HEK293細胞において活性型Rasを発現させるとRafの活性化が観察されるが、この時に活性型Srcを共発現させるとRafの活性は相乗的に上昇することが観察された。また活性型Src単独でもRafを部分的に活性化した。この活性型SrcによるRafの活性化はRasの優性抑制型変異体(Ras[S17N])によって強く抑制された。また細胞にチロシンキナーゼの阻害剤であるハービマイシンAを作用させたところ、活性型RasによるRafの活性化が抑えられた。さらに我々は優性抑制型変異体であるRas[G12V,C186S]がRafを細胞質に捕捉することによって活性型RasによるRafの活性化を阻害してしまうことを見い出したが、この変異体は活性型SrcによるRafの活性化や活性型Rasと活性型Srcの共発現によるRafの活性化も抑制した。これらのことから、RasやSrcによるRafの活性化は細胞膜上で起き、その際RasとSrcが互いに不可欠であると思われる。現在、in vitroの系を用いて実際にRasとSrcが協同的にRafを活性化するかどうかを検討中である。