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低温下における蛋白質X線結晶構造解析による蛋白質熱振動の研究

利用蛋白质低温X射线晶体结构分析研究蛋白质热振动

基本信息

批准号：
07280230
负责人：
中迫雅由
金额：
$ 0.7万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07280230/
关键词：
低温蛋白質X線結晶構造解析蛋白質熱振動蛋白質物性

项目摘要

本研究課題では、低温下での蛋白質振動の熱的挙動を詳細に研究するための技術開発とその初期的な応用を行った。低温下での蛋白質X線結晶構造解析技術の確立蛋白質結晶のX線露光時の放射線損傷を低減させ、低温下での蛋白質の熱振動挙動研究のために、蛋白質結晶を100K程度の低温に急速冷却し回折強度測定を行うための技術検討を行った。特に、結晶の急速冷却のために100μm程度の厚みにスライスしたキャピラリーを結晶マウント具として用いる方法を開発した。国内では、低温実験がまだ未発達であり、その普及のために、本研究で確立された低温実験における一連の方法論や過程の詳細についてまとめた小冊子(Nakasako, "Methods in cryogenic protein crystallography")を作成し配布した。今回開発された方法は、実験室ならびに放射光実験施設において実際に適用され、低温下でのX線回折実験の有効性が確認された。トリプシン、イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素、放射線損傷に対して脆弱なH2プロテアーゼ、ニトリルヒドラターゼ結晶の回折強度測定に適用された。トリプシンの低温下X線回折実験蛋白質の低温物性をX線結晶構造解析の立場から探索して行くために、典型的な酵素であるトリプシンに着目して低温下X線回折実験を開始した。今後の研究の基礎データを確立すべく、3種類(斜方晶系2種類、三方晶系1種類)の結晶について低温下(100K)および室温下での回折実験および構造精密化を行い、蛋白質構造の温度変化、低温下での水和水のネットワーク構造を解析した。特に、蛋白質を取り囲む水分子の水素結合ネットワークには水分子を100以上含むものであり、蛋白質の熱振動に大きな影響を及ぼしていることが推察された。構造精密化後の水分子の配置解析のために、専用のプログラム開発(FESTKOP)も行った。耐熱性および改変イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素の低温結晶構造解析イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素の熱安定性は複数種のキメラおよび点突然変異酵素を用いて議論されてきたが、幾つかの改変酵素についてはその熱安定性を十分に説明できないでいる。本研究では、まず、改変酵素の水和構造の差異がその熱安定性に如何に関わるかを検討するために耐熱性とその改変型の低温構造解析を行ってた。野性型については、通常の蛋白質と同じく低温下でガラス転移点を持つことが示唆された。また、改変酵素(2T2M6T_S82R)は構造が揺らぎやすいことが示された。

This research topic is to study the thermal vibration of protein at low temperature in detail, and to carry out the preliminary application of this technology. X-ray crystallographic analysis of protein at low temperature; establishment of protein crystals; X-ray exposure; radiation damage reduction; thermal vibration study of protein at low temperature; rapid cooling of protein crystals at low temperature to 100K; and measurement of flexural strength. Special, rapid cooling of the crystal to 100μm thick, rapid cooling of the crystal to 100 μ m thick. This study established a detailed methodology for the development and popularization of low temperature systems in China (Nakasako, "Methods in cryogenic protein crystallography"). The method developed in this paper is suitable for practical application in laboratory and radiation facilities, and the effectiveness of X-ray reflection at low temperature is confirmed. For the determination of refractive strength of fragile H2 crystals, soft crystals, acid dehydrases, and radiation damage X-ray folding of proteins at low temperatures has begun to explore the position of X-ray crystal structure analysis, typical enzymes and X-ray folding at low temperatures. Future research will focus on the establishment of basic structures, crystallization of three types (orthorhombic 2 types, trigonal 1 type) at low temperatures (100K) and at room temperatures, structural refinement, temperature changes in protein structure, and structural analysis of water and water at low temperatures. In particular, the protein is extracted from the water molecule and the water element is combined with the water molecule. The protein contains more than 100 particles. The thermal vibration of the protein is greatly affected. The structure of water molecules after precision analysis of the structure of the application of the development (FESTKOP) Heat resistance and thermal stability of acid dehydrin enzyme are discussed in detail. In this study, we analyzed the thermal stability of different types of enzymes and their structural differences. Wild type of protein, usually the same as the low temperature, the shift point is maintained. The enzyme (2T2M6T_S82R) was constructed to be a ".