低温下における蛋白質X線結晶構造解析による蛋白質熱振動の研究

利用蛋白质低温X射线晶体结构分析研究蛋白质热振动

• 批准号: 07280230
• 负责人: 中迫 雅由
• 金额: $ 0.7万
• 依托单位: The Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07280230/
• 关键词: 低温蛋白質X線結晶構造解析; 蛋白質熱振動; 蛋白質物性

本研究課題では、低温下での蛋白質振動の熱的挙動を詳細に研究するための技術開発とその初期的な応用を行った。低温下での蛋白質X線結晶構造解析技術の確立蛋白質結晶のX線露光時の放射線損傷を低減させ、低温下での蛋白質の熱振動挙動研究のために、蛋白質結晶を100K程度の低温に急速冷却し回折強度測定を行うための技術検討を行った。特に、結晶の急速冷却のために100μm程度の厚みにスライスしたキャピラリーを結晶マウント具として用いる方法を開発した。国内では、低温実験がまだ未発達であり、その普及のために、本研究で確立された低温実験における一連の方法論や過程の詳細についてまとめた小冊子(Nakasako, "Methods in cryogenic protein crystallography")を作成し配布した。今回開発された方法は、実験室ならびに放射光実験施設において実際に適用され、低温下でのX線回折実験の有効性が確認された。トリプシン、イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素、放射線損傷に対して脆弱なH2プロテアーゼ、ニトリルヒドラターゼ結晶の回折強度測定に適用された。トリプシンの低温下X線回折実験蛋白質の低温物性をX線結晶構造解析の立場から探索して行くために、典型的な酵素であるトリプシンに着目して低温下X線回折実験を開始した。今後の研究の基礎データを確立すべく、3種類(斜方晶系2種類、三方晶系1種類)の結晶について低温下(100K)および室温下での回折実験および構造精密化を行い、蛋白質構造の温度変化、低温下での水和水のネットワーク構造を解析した。特に、蛋白質を取り囲む水分子の水素結合ネットワークには水分子を100以上含むものであり、蛋白質の熱振動に大きな影響を及ぼしていることが推察された。構造精密化後の水分子の配置解析のために、専用のプログラム開発(FESTKOP)も行った。耐熱性および改変イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素の低温結晶構造解析イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素の熱安定性は複数種のキメラおよび点突然変異酵素を用いて議論されてきたが、幾つかの改変酵素についてはその熱安定性を十分に説明できないでいる。本研究では、まず、改変酵素の水和構造の差異がその熱安定性に如何に関わるかを検討するために耐熱性とその改変型の低温構造解析を行ってた。野性型については、通常の蛋白質と同じく低温下でガラス転移点を持つことが示唆された。また、改変酵素(2T2M6T_S82R)は構造が揺らぎやすいことが示された。

This research topic で で は, low temperature の protein の thermal vibration 挙 move を detailed study に す る た め の technology open 発 と そ の early な 応 line with を っ た. Low temperature で の protein X-ray crystal structure parsing techniques when we set up protein crystallization の X-ray exposure の の を low radiation damage reduction さ で せ, low temperature の protein の thermal vibration 挙 research is の た め に, degree of protein crystallization を 100 k の に at low temperature cooling and し inflexion strength measurement line を う た め の technology 検 line for を っ た. に, crystallization, の rapid cooling の た め に 100 microns thick degree の み に ス ラ イ ス し た キ ャ ピ ラ リ ー を crystallization マ ウ ン ト with と し て in い る method を open 発 し た. Domestic で は, low temperature be 験 が ま だ not 発 da で あ り, そ の popularization の た め に, this study で establish さ れ た low temperature be 験 に お け る の detailed methodology for の や process に つ い て ま と め た booklet (Nakasako, "Methods in cryogenic protein crystallography")を was made into a plate of た. Today back to open 発 さ れ は た method, be 験 chamber な ら び に radiation light be 験 facilities に お い て be interstate に applicable さ で れ, low temperature の X-ray inflexion be 験 の have sharper sex が confirm さ れ た. ト リ プ シ ン, イ ソ プ ロ ピ ル リ ン ゴ acid dehydration vegetable enzyme, radiation damage に し seaborne て fragile な H2 プ ロ テ ア ー ゼ, ニ ト リ ル ヒ ド ラ タ ー ゼ crystallization の inflexion strength measurement に applicable さ れ た. X-ray ト リ プ シ ン の low temperature inflexion be 験 protein の cryogenic property を X-ray crystal structure parsing の position か ら explore し て line く た め に, typical な enzymes で あ る ト リ プ シ ン に with mesh し X-ray て low temperature inflexion be 験 を began し た. Future research based デ の の ー タ を establish す べ く, 3 species (orthorhombic system 2 kinds, 1 kind trigonal system) の crystallization に つ い て under low temperature (100 k) お よ び room temperature で の inflexion be 験 お よ び tectonic line motors を い の temperature variations, protein structure, the low temperature で の water and water の ネ ッ ト ワ ー ク tectonic analytical し を た. に, protein を take り 囲 の む water molecules of water element combination ネ ッ ト ワ ー ク に を は water molecules contains more than 100 む も の で あ り, protein の thermal vibration に big き な influence を and ぼ し て い る こ と が push examine さ れ た. After the construction is refined, the <s:1> water molecule <s:1> configuration analysis <e:1> ために and the dedicated <s:1> プログラム development (FESTKOP) <s:1> row った. Heat resistant お よ び change - イ ソ プ ロ ピ ル リ ン ゴ acid dehydration vegetable enzyme の crystallizing structure イ ソ プ ロ ピ ル リ ン ゴ acid dehydration vegetable enzyme の thermal stability は plural kinds of の キ メ ラ お よ び point - suddenly isoenzymes を with い て comment さ れ て き た が, several つ か の change - enzyme に つ い て は そ の thermal stability を very に illustrate で き な い で い る. This study で は, ま ず change - and enzyme の differences in water and tectonic の が そ の how thermal stability に に masato わ る か を beg す 検 る た め に heat-resistant と そ の の change - type low temperature structure line を っ て た. The wild type に に て て て された, and the usual <s:1> protein と and じく at low temperatures show a でガラス転 migration site を and a とが とが indicating された. Youdaoplaceholder0, modification enzyme (2T2M6T_S82R) また structure が shaken らぎやす とが とが とが shows された.

项目成果

Masayoshi Nakasako: "Acrystal mounting device made from capillary tube for cryogenic macromolecular crystallography" Journal of applied crystallography. 28. (1995)

Masayoshi Nakasako：“由毛细管制成的用于低温高分子晶体学的晶体安装装置”应用晶体学杂志。

Chikahiro Nagata: "Cryo crystallograpy of 3-Isopropylmalate dehydrognase from thermus thermophilus and its chimeric en3yme." Acta Crystallographica Section D.5/(印刷中). (1996)

Chikahiro Nagata：“来自嗜热菌的 3-异丙基苹果酸脱氢酶及其嵌合酶的冷冻晶体学。”《晶体学报》第 D.5 节/（出版中）。

中迫雅由: "蛋白質結晶の液体窒素温度への冷却方法" 日本生物物理学会誌. 37(印刷中). (1996)

Masayoshi Nakasako：“将蛋白质晶体冷却至液氮温度的方法”，日本生物物理学会杂志 37（出版中）。

中迫雅由: "低温下での蛋白質X線結晶解析技術" 日本結晶学会誌. 37. 266-270 (1995)

Masayoshi Nakasako：“低温下的蛋白质X射线晶体分析技术”日本晶体学会杂志37。266-270（1995）。