大腸菌Ada蛋白質-DNA複合体の立体構造解析と認識機構

大肠杆菌Ada蛋白-DNA复合物三维结构分析及识别机制

• 批准号: 08260206
• 负责人: 大久保 忠恭
• 金额: $ 1.54万
• 依托单位: Japan Advanced Institute of Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08260206/
• 关键词: NMR; 転写制御; Ada蛋白質

大腸菌のDNA修復蛋白質Adaの分子量16kDaのN末側機能ドメイン(N-ada16k)のDNA認識機構と修復系の活性発現と制御の仕組みについて、Ada蛋白質-DNA複合体のNMR解析により研究を行った。N-ada16kの遺伝子を大腸菌に組み込んだ大量発現系を構築した。培養及び精製条件を検討し、M9最小培地で収量20mg/Lの系を構築した。N-ada16kはCys69がメチル化されると転写制御因子として働くので、反応条件の検討によりCys69が選択的にメチル化されたme-C69 N-ada16kを調整した。この系を用いて蛋白質を^<13>C,^<15>N安定同位体ラベルしNMRシグナルの帰属と2次構造の同定を行ないN-ada16kとme-C69 N-ada16kの^<15>N-^1H HMQC及び^<113>CdNMRスペクトルを比較した。さらに、両者とDNAの複合体の^<15>N-^1H HMQCスペクトルの解析を行なった。DNAとの複合体形成によりDNA結合に関与する残基のNMRシグナルが線幅増大により観測されなくなった。この結果よりN-ada16kはHTH-DNA結合モチーフの領域でのみDNAと非特異的結合をしていることが明らかとなった。me-C69 N-ada16kではHTH-DNA結合モチーフの領域とCys69を含む亜鉛結合部位がDNAと特異的結合をしていることが明らかとなった。変異体の結果は、HTH-DNA結合モチーフの領域がDNA認識に直接関与していることを示していた。即ち、メチル化により新たにCys69を含む亜鉛結合部位がDNAと相互作用することにより、me-C69 N-ada16kは特定のDNA配列を確認することが可能となると考えられた。現在、この相互作用の詳細を明らかにするためにme-C69 N-ada16kとDNAの複合体の立体構造解析を行っている。

DNA repair protein Ada of Escherichia coli DNA recognition machine with molecular weight 16kDa and functional N-terminal side (N-ada16k) NMR analysis of the Ada protein-DNA complex and NMR analysis of the structure and repair system were carried out. N-ada16k's の伝子を coliform group み込んだa large number of 発appears the system をconstructs した. The culture and purification conditions are the same, and the M9 minimum cultivation volume is 20mg/L. N-ada16kはCys69がメチル化されると転WRITE CONTROL FACTORとして働くので、Reflection condition の検検検によりCys69が选択にメチル化されたme-C69 N-ada16kを Adjustmentした.このを用いてproteinを^<13>C,^<15>N stable isotope ラベルしNMRシグナルの帰genと2nd structureの同定を行ないN-ada16kとme-C69 N-ada16kの^<15>N-^1H HMQC and び^<113>CdNMR スペクトルをComparison した.さらに、両者とDNAのplexの^<15>N-^1H HMQCスペクトルのanalyticsを行なった. The DNA complex is formed and the NMR of the DNA binding residues is increased and the line width is increased.このRESULTSよりN-ada16kはHTH-DNA binding モチーフの区でのみDNAと non-specific binding をしていることが明らかとなった. me-C69 N-ada16k HTH-DNA binding domain and Cys69 binding site contain DNA and specific binding properties. The result of heterogeneity and the understanding of DNA in the field of HTH-DNA binding are directly related to the detection of DNA. That is, ち, メチル化により新たにCys69をcontains む亜lead binding site がDNA and interaction することにより, me-C69 N-ada16k's specific DNA alignment is confirmed and possible. Now, the detailed analysis of the three-dimensional structure of the N-ada16k and DNA complex of Me-C69 N-ada16k and DNA complex has been carried out.

项目成果

H.Sakashita: "Sequence-specific DNA recognition of the Escherichia coli Ada protein associated with the methylation-dependent functional switch for transcriptional regulation" J.Biochem.118. 1184-1191 (1995)

H.Sakashita：“大肠杆菌 Ada 蛋白的序列特异性 DNA 识别与转录调节的甲基化依赖性功能开关相关”J.Biochem.118。

T.Ohkubo: "Methylation dependent functional switch mechanism newly found in the Escherichia coli Ada protein" J.Am.Chem.Soc.116. 6035-6036 (1994)

T.Ohkubo：“在大肠杆菌 Ada 蛋白中新发现的甲基化依赖性功能开关机制”J.Am.Chem.Soc.116。

大久保忠恭: "Ada蛋白質の構造と機能" 核酸化学の新展開:蛋白質核酸酵素別冊. 40. 438-444 (1995)

大久保忠康：《Ada蛋白质的结构与功能》核酸科学新进展：蛋白质核酸酶特刊40。438-444（1995）

H.Sakashita: "Folding topology and DNA binding of the N-terminal fragment of Ada protein" FEBS Letter. 323. 252-256 (1993)

H.Sakashita：“Ada 蛋白 N 末端片段的折叠拓扑和 DNA 结合”FEBS Letter。

H。Sakashita: "Methylation dependent functional switch mechanism of the Escherichia coli Ada protein" Proc.Japan Acad.71. 198-201 (1995)

H。