大腸菌Ada蛋白質-DNA複合体の立体構造解析と認識機構

大肠杆菌Ada蛋白-DNA复合物三维结构分析及识别机制

• 批准号: 09249206
• 负责人: 大久保 忠恭
• 金额: $ 0.45万
• 依托单位: Japan Advanced Institute of Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09249206/
• 关键词: NMR; 大腸菌Adaタンパク質; DNA結合部位

大腸菌のDNA修復蛋白質AdaはDNA修復反応に伴う自身のCys69チオール基のメチル化により、特定のDNA配列(ada遺伝子のプロモーター領域及び他のDNA修復蛋白質をコードするalkA遺伝子のプロモーター領域)に対する親和性が千倍以上大きくなり転写制御因子として作用する。僅か一個のメチル基の付加が引き起こす立体構造上の変化により、活性が大きく変化するため、Adaはタンパク質の機能スイッチのよいモデル系となると考えられる。さらに興味深いことにAdaはada遺伝子に対しては負の転写制御を行ない、alkA遺伝子に対しては正の転写制御行っている。このメカニズムを解明するには、DNAと蛋白質の相互作用を分子レベルで詳細に解析することが必要である。そこで、NMRを用いて転写制御活性を特つメチル化したAda蛋白質N末ドメイン(N-ada16k)とDNAの複合体の解析を行った。大腸菌の大量発現系を用いてNMR測定に必要な20-40mgの蛋白質試料を得た。また、アルキル化剤処理によりメチル化したDNAとN-ada16kを室温で反応させることにより、N-ada16kのDNAメチルトランスフェラーゼ活性を利用して、Cys69のメチル化を行なった。NMRスペクトルの結果よりCys69だけを選択的にほぼ、100%メチル化したN-ada16k(me-C69 N-ada16k)を得ることができた。N-ada16kが転写制御因子として作用する機構を調べるためme-C69 N-ada16kとada並びにalkAプロモーター領域のDNAとの複合体の^<15>N-^1H HMQCスペクトルの解析を行なった。DNA添加時のスペクトル変化により結合部位の情報を得た。me-C69 N-ada16kはada遺伝子のプロモータ領域にはhelix-turn-helix DNA結合モチーフの領域とCys69を含む亜鉛結合部位の2カ所でDNAと特異的結合をしていた。alkA遺伝子の場合、新たにN末端部位もDNA結合に関与しているため、この領域がDNAコンセンサス配列の上流と結合すると考えられた。即ち、Adaタンパク質はaikA遺伝子の場合、3ヶ所でDNAと結合していると考えられる。この違いが転写活性の違いにつながると示唆された。

Coliform の DNA repair protein Ada は DNA repair the 応 に with う itself の Cys69 チ オ ー ル base の メ チ ル change に よ り, specific の DNA match column (Ada heritage 伝 son の プ ロ モ ー タ ー field and び he の DNA repair protein を コ ー ド す る alkA heritage 伝 son の プ ロ モ ー タ ー) に す seaborne る affinity が more than one thousand times larger Youdaoplaceholder0 くな 転 転 write the control factor と て action する. か only a の メ チ ル base pay plus が の lead き up こ す の on three-dimensional structure - the に よ り, large active が き く variations change す る た め, Ada は タ ン パ ク qualitative の function ス イ ッ チ の よ い モ デ ル department と な る と exam え ら れ る. さ ら に tumblers deep い こ と に Ada は Ada heritage 伝 son に し seaborne て は negative の planning write suppression を line な い, alkA but 伝 に し seaborne て は is の line planning write suppression っ て い る. こ の メ カ ニ ズ ム を interpret す る に は protein, DNA と の を molecular interaction レ ベ ル で detailed analytical す に る こ と が necessary で あ る. そ こ で, NMR を い て write planning を suppression activity especially つ メ チ ル change し た Ada protein at the end of the N ド メ イ ン (N - ada16k) と の DNA complex analytical line を っ の た. The large presence of escherichia coli samples is determined by を using てNMR to determine に. It is necessary to な20-40mg of <s:1> protein sample を to obtain た. ま た, ア ル キ ル the tonic 処 Richard に よ り メ チ ル change し た DNA と N - ada16k を room-temperature で anti 応 さ せ る こ と に よ り, N - ada16k の DNA メ チ ル ト ラ ン ス フ ェ ラ ー を ゼ activity using し て, Cys69 の メ チ ル change line を な っ た. NMR ス ペ ク ト ル の results よ り Cys69 だ け を sentaku of に ほ ぼ, 100% メ チ ル change し た N - ada16k (me - C69 N - ada16k) を must る こ と が で き た. N - ada16k が planning write suppression factor と し て role す る institutions を adjustable べ る た め me - C69 N - ada16k と Ada and び に alkA プ ロ モ ー タ ー field の DNA と の complex の ^ < 15 > N - h ^ 1 HMQC ス ペ ク ト ル の parsing line を な っ た. When DNA is added, the <s:1> スペ, ト and ト are subjected to the によ and <s:1> of the binding site <e:1> information を to た. Traces of me - C69 N - ada16k は Ada 伝 son の プ ロ モ ー タ field に は helix - turn - helix DNA binding モ チ ー フ の field と Cys69 を containing む 亜 lead combining site の 2 カ で と specific DNA by combining を し て い た. AlkA heritage 伝 の occasion, new た に N terminal parts も dna-binding に masato and し て い る た め, こ の field が DNA コ ン セ ン サ ス match column の upper と combining す る と exam え ら れ た. Namely ち, Ada タ ン パ ク qualitative は aikA heritage 伝 の occasions, 3 ヶ で DNA と combining し て い る と exam え ら れ る. <s:1> <s:1> violation of が転 write active <s:1> violation of に ながると ながると indicate された.

项目成果

K.Yamasaki: "Solution structure of an extracelluar domain containing the WSxWS motif of the granulocyte colony-stimulating factor receptor and its interaction with ligand" Nature Structural Biology. 4. 498-504 (1997)

K.Yamasaki：“含有粒细胞集落刺激因子受体 WSxWS 基序的细胞外结构域的溶液结构及其与配体的相互作用”《自然结构生物学》。