大腸菌Ada蛋白質-DNA複合体の立体構造解析と認識機構

大肠杆菌Ada蛋白-DNA复合物三维结构分析及识别机制

• 批准号: 08260206
• 负责人: 大久保 忠恭
• 金额: $ 1.54万
• 依托单位: Japan Advanced Institute of Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08260206/
• 关键词: NMR; 転写制御; Ada蛋白質

大腸菌のDNA修復蛋白質Adaの分子量16kDaのN末側機能ドメイン(N-ada16k)のDNA認識機構と修復系の活性発現と制御の仕組みについて、Ada蛋白質-DNA複合体のNMR解析により研究を行った。N-ada16kの遺伝子を大腸菌に組み込んだ大量発現系を構築した。培養及び精製条件を検討し、M9最小培地で収量20mg/Lの系を構築した。N-ada16kはCys69がメチル化されると転写制御因子として働くので、反応条件の検討によりCys69が選択的にメチル化されたme-C69 N-ada16kを調整した。この系を用いて蛋白質を^<13>C,^<15>N安定同位体ラベルしNMRシグナルの帰属と2次構造の同定を行ないN-ada16kとme-C69 N-ada16kの^<15>N-^1H HMQC及び^<113>CdNMRスペクトルを比較した。さらに、両者とDNAの複合体の^<15>N-^1H HMQCスペクトルの解析を行なった。DNAとの複合体形成によりDNA結合に関与する残基のNMRシグナルが線幅増大により観測されなくなった。この結果よりN-ada16kはHTH-DNA結合モチーフの領域でのみDNAと非特異的結合をしていることが明らかとなった。me-C69 N-ada16kではHTH-DNA結合モチーフの領域とCys69を含む亜鉛結合部位がDNAと特異的結合をしていることが明らかとなった。変異体の結果は、HTH-DNA結合モチーフの領域がDNA認識に直接関与していることを示していた。即ち、メチル化により新たにCys69を含む亜鉛結合部位がDNAと相互作用することにより、me-C69 N-ada16kは特定のDNA配列を確認することが可能となると考えられた。現在、この相互作用の詳細を明らかにするためにme-C69 N-ada16kとDNAの複合体の立体構造解析を行っている。

The molecular weight of 16kDa N-terminal functional domain of DNA repair protein Ada in E. coli was studied. The molecular weight of Ada was 16 kDa. The activity of DNA recognition mechanism and repair system was studied. The NMR analysis of Ada protein-DNA complex was carried out. N-ada 16k DNA is a major component of E. coli. Culture and purification conditions were discussed, and the system of M9 minimum culture concentration of 20mg/L was constructed. N-ada 16 k Cys69 is the only one that can be adjusted by the control factor and the inverse condition. This system uses a protein to stabilize isotopes, such as <13>C, <15>N, and Cd NMR. The structure of the system is determined by the identity of N-ada 16 k and me-C69 N-ada 16k<15><113>. In addition, the analysis of the ^ N-^1H HMQC element of the complex between the molecule and DNA <15>was carried out. DNA complexes are formed by DNA binding, and NMR spectra of residues involved in DNA binding are amplified. The result is that N-ada16k binds to HTH-DNA in the domain of non-specific DNA binding. me-C69 N-ada16k HTH-DNA binding The results of HTH-DNA binding are directly related to DNA recognition. Cys69 contains a lead binding site and DNA interaction. Now, the interaction between me-C69N-ada 16k and DNA complex is analyzed in detail.

项目成果

H.Sakashita: "Sequence-specific DNA recognition of the Escherichia coli Ada protein associated with the methylation-dependent functional switch for transcriptional regulation" J.Biochem.118. 1184-1191 (1995)

H.Sakashita：“大肠杆菌 Ada 蛋白的序列特异性 DNA 识别与转录调节的甲基化依赖性功能开关相关”J.Biochem.118。

T.Ohkubo: "Methylation dependent functional switch mechanism newly found in the Escherichia coli Ada protein" J.Am.Chem.Soc.116. 6035-6036 (1994)

T.Ohkubo：“在大肠杆菌 Ada 蛋白中新发现的甲基化依赖性功能开关机制”J.Am.Chem.Soc.116。

大久保忠恭: "Ada蛋白質の構造と機能" 核酸化学の新展開:蛋白質核酸酵素別冊. 40. 438-444 (1995)

大久保忠康：《Ada蛋白质的结构与功能》核酸科学新进展：蛋白质核酸酶特刊40。438-444（1995）

H.Sakashita: "Folding topology and DNA binding of the N-terminal fragment of Ada protein" FEBS Letter. 323. 252-256 (1993)

H.Sakashita：“Ada 蛋白 N 末端片段的折叠拓扑和 DNA 结合”FEBS Letter。

H。Sakashita: "Methylation dependent functional switch mechanism of the Escherichia coli Ada protein" Proc.Japan Acad.71. 198-201 (1995)

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