哺乳動物細胞におけるサイクリンB特異的ユビキチン化とその調節機構の解明

哺乳动物细胞中cyclin B特异性泛素化及其调控机制的阐明

• 批准号: 09267236
• 负责人: 田中 弘文
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: Tokyo University of Pharmacy and Life Science
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09267236/
• 关键词: 哺乳動物細胞; 細胞周期; サイクリン; ユビキチン; 蛋白質分解

細胞周期のM期の終了にはサイクリンBの分解に依存したMPFの不活性化が必要であり、サイクリンBはM期中期から後期の移行期にユビキチン化に依存したプロテアソーム系を介して分解される。一般に蛋白質のユビキチン化にはユビキチン活性化酵素(E1)、運搬酵素(E2)、リガーゼ(E3)の3種の酵素が必要であるが、E2-C(clam),UBCx(xenopus),hE2-C/UbcH10(human)がサイクリンB特異的E2としてクローニングされ、またサイクロソームあるいはAPC(anaphase promoting complex)と呼ばれるcdc16/cdc27を含む沈降定数20Sの複合体にE3活性が存在することが示された。しかしながら哺乳動物の体細胞分裂時におけるサイクリンBのユビキチン化については依然不明の点が多い。そこで先ずhE2-C/UbcH10に対する抗体を作製し、細胞周期における蛋白質の変動を検討した結果、UbcH10は細胞周期のどの時期でもほぼ同じ量が発現している事が明らかとなった。また、細胞内ではそのほとんどが細胞質画分に存在し、塩で抽出可能なクロマチン画分にも少量存在した。次に、Two-Hybrid法によりhE2-C/UbcH10と相互作用する蛋白質の単離を試みた。マウスlymphoma cDNA libraryから得られた2個のクローンは共に同じく202個のアミノ酸からなる蛋白質をコードし、そのC末にはp53に対するE3であるE6-APから見い出されたHECTドメイン様配列が存在した。さらに、5'RACE法によりHeLa細胞からヒトの全長cDNA(H10BH:UbcH10 binding protein with HECT-like domain)を単離した。H10BH蛋白は、UbcH10と結合するだけでなく、サイクリンBならびにcdc27とも結合した。さらに、サイクリンBのユビキチン化の系(HeLa細胞の抽出液存在下)にH10BHを発現させたSf9細胞の抽出液を添加すると、サイクリンBのユビキチン化が促進された。以上の結果からH10BHがサイクリンBに対するE3である可能性が示唆された。

The end of the cell cycle depends on the decomposition of MPFs and the end of the cell cycle depends on the decomposition of MPFs. Three enzymes, namely, enzyme (E1), enzyme (E2) and enzyme (E3), are essential for protein production. E2-C (clamp), UBCx (xenopus), hE2-C/UbcH10 (human) are essential for protein production. APC (anaphase promoting complex) and cdc16/cdc27 are also present in the complex containing 20S. In mammals, there are still many unknown points when somatic cells divide. The results of the study of protein activity in the cell cycle of hE2-C/UbcH10 and the detection of protein activity in the cell cycle of hE2-C/UbcH10 are as follows: In the cell, there is a small amount of cytoplasm, and there is a small amount of cytoplasm Second, the Two-Hybrid method is used to analyze the protein separation between hE2-C and UbcH10. A total of 202 protein fragments were identified in the cDNA library. The protein fragments were identified at the end of p53 and E3, E6-AP and HECT. The full-length cDNA (H10BH: UbcH 10 binding protein with HECT-like domain) was isolated from HeLa cells by 5 'RACE. H10BH is white, UbcH10 is white, and cdc27 is white. In addition, H10BH production and Sf9 cell culture were promoted in the presence of HeLa cell culture extract and in the presence of Sf9 cell culture extract. The above results show that H10BH is the most likely candidate for E3.

项目成果

Hiromori Funabiki: "Fission yeast Cut2 required for anaphase has two destruction boxes." The EMBO Journal. 16・19. 5977-5987 (1997)

Hiromori Funabiki：“后期所需的裂变酵母 Cut2 有两个破坏盒。” EMBO Journal 16・19（1997）。

Reiko Honda: "Oncoprotein MDM2 is a ubiquitin ligase E3 for tumor suppressor p53." FEBS Letters. 420・1. 25-27 (1997)

Reiko Honda：“癌蛋白 MDM2 是肿瘤抑制因子 p53 的泛素连接酶 E3。” FEBS Letters 420・1 (1997)。