サイクリンBに特異的なコビキチン化酵素の単離

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M期開始に関わるMPFはサイクリンB/cdc2複合体で、cdc2の特定部位のリン酸化・脱リン酸化を介して活性化され、細胞はM期に進行する。M期の終了にはサイクリンBの分解に依存したMPFの不活性化が必要であり、サイクリンBはM期中期から後期の移行期に急激に分解される。このサイクリンBの分解はユビキチン化に依存したプロテアソーム系を介して行われると考えられているがその詳細は未だ明らかでない。そこで本研究では、哺乳動物細胞を用いたサイクリンBのユビキチン化の系を開発するとともに、サイクリンBの分解に関与する因子を同定する事を目的にサイクリンBと結合する蛋白質の単離を試みた。1.サイクリンBユビキチン化のin vitro系の開発:バキュロウイルス系で発現させたGST-サイクリンB融合蛋白質、ビオチン化ユビキチンを基質として、HeLa細胞の抽出液を酵素源としたin vitroの系を確立した。この系にユビキチン活性化酵素(E1)、ならびにユビキチン輸送蛋白(UBC4,UBCH5)を添加することでサイクリンBのユビキチン化が著しく促進された。またサイクリンBのユビキチン化は細胞周期依存性で分裂期の抽出液が最も高い活性を示した。2.サイクリンBを認識する蛋白質の単離:yeast two-hybrid systemを用いてサイクリンBを認識する蛋白質をスクリーニングした結果、細胞内小胞輸送に関与するコート蛋白質の一つである,β′-COPのヒト及びウシcDNAと高い相同性を持つマウスcDNAが単離された。このマウスβ′-COPとサイクリンBとの結合を検討したところ、β′-COPのC末側とサイクリンBのN末側が結合することが明らかとなった。今後、精製蛋白を用いたサイクリンBユビキチン化の再構成系を開発するとともに、β′-COPのサイクリンBユビキチン化への関与を明らかにする必要がある。