体内時計の光位相同調とメラトニン出力系の調節メカニズム

生物钟的光相位同步及褪黑激素输出系统的调节机制

基本信息

批准号：
11233202
负责人：
深田吉孝
金额：
$ 39.74万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

交付申請書に記載の研究実施計画に沿って研究を遂行し、下記の成果を得た。1.光依存的転写調節に関わる遺伝子配列(光応答エレメント)を同定するため、光に応答するピノプシン遺伝子のプロモータの解析を行った。その結果、18塩基からなる光応答エレメントを同定することに成功した。また、ゲルシフト解析の結果、この光エレメントに作用する因子は、肝臓等の種々の臓器に発現する転写抑制因子であることがわかった。2.概日時計発振系におけるMAPキナーゼの生理的役割の解明を目指して、咋年度に続きMAPキナーゼの標的分子を探索した。In vitroでのキナーゼアッセイの結果、BMAL1に加え、クリプトクローム(CRY1およびCRY2)がMAPキナーゼによってリン酸化されることが判明した。転写アッセイに基づく機能解析の結果、MAPキナーゼによるリン酸化に伴ってクリプトクロームの転写抑制能が修飾されることが分かった。そこで、リン酸化部位を特異的に認識する抗体を作製し、このようなリン酸化が生体内でおこっているかどうかを調べた。その結果、培養細胞において強制発現させたCRY1およびCRY2の特定のアミノ酸残基がMAPキナーゼによってリン酸化されることが明らかとなった。3.エクソロドプシンプロモータは、ゼブラフィッシュにおいて松果体特異的な遺伝子発現を誘導する。このプロモータを利用し、概日時計の発振における時計遺伝子産物(BMAL1およびBMAL2)の機能を明らかにすべく、これらBMALのドミナントネガティブ体を松果体特異的に発現するトランスジェニックゼブラフィッシュを複数系統樹立した。現在、これら個体のメラトニンリズムの解析を進めている。これと並行して、エクソロドプシンプロモータにおいて、松果体特異的な遺伝子発現を誘導するエレメントを決定しPIPE(Pineal Expression Promoting Element)と命名した。

该研究是根据申请表中列出的研究实施计划进行的，并获得了以下结果。 1。确定与光依赖性转录调控有关的基因序列（光响应元件），分析了光反应性pinopsin基因的启动子。结果，我们成功地确定了由18个碱基组成的光反应元件。此外，凝胶转移分析表明，作用于该光光元素的因素是在肝等各种器官中表达的转录阻遏物。 2。在KUI财政年度之后，我们搜索了目标分子的地图激酶，目的是阐明MAP激酶在昼夜节律时钟振荡系统中的生理作用。体外激酶测定法表明，除了BMAL1外，MAP激酶还磷酸化了加密斑块（CRY1和CRY2）。基于转录测定的功能分析表明，通过MAP激酶通过磷酸化来修饰加密色素的转录抑制能力。因此，一种专门识别磷酸化位点的抗体，并检查了体内是否发生这种磷酸化。结果，揭示了CRY1和CRY2的某些氨基酸残基在培养细胞中被迫用MAP激酶磷酸化。 3。驱体蛋白启动子在斑马鱼中诱导松果特异性基因表达。使用该启动子，我们建立了多个转基因斑马鱼，这些斑马鱼在松果腺中特别表达BMAL的主要负体，以阐明昼夜节律时钟时钟振荡的时钟基因产物（BMAL1和BMAL2）的功能。目前，我们正在分析这些人的褪黑激素节奏。同时，确定了驱虫蛋白启动子中诱导松果特异性基因表达的元素并命名为管道（松果表达促进元件）。