体内時計の光位相同調とメラトニン出力系の調節メカニズム

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交付申請書に記載の研究実施計画に沿って研究を遂行し、下記の成果を得た。1.光依存的転写調節に関わる遺伝子配列(光応答エレメント)を同定するため、光に応答するピノプシン遺伝子のプロモータの解析を行った。その結果、18塩基からなる光応答エレメントを同定することに成功した。また、ゲルシフト解析の結果、この光エレメントに作用する因子は、肝臓等の種々の臓器に発現する転写抑制因子であることがわかった。2.概日時計発振系におけるMAPキナーゼの生理的役割の解明を目指して、咋年度に続きMAPキナーゼの標的分子を探索した。In vitroでのキナーゼアッセイの結果、BMAL1に加え、クリプトクローム(CRY1およびCRY2)がMAPキナーゼによってリン酸化されることが判明した。転写アッセイに基づく機能解析の結果、MAPキナーゼによるリン酸化に伴ってクリプトクロームの転写抑制能が修飾されることが分かった。そこで、リン酸化部位を特異的に認識する抗体を作製し、このようなリン酸化が生体内でおこっているかどうかを調べた。その結果、培養細胞において強制発現させたCRY1およびCRY2の特定のアミノ酸残基がMAPキナーゼによってリン酸化されることが明らかとなった。3.エクソロドプシンプロモータは、ゼブラフィッシュにおいて松果体特異的な遺伝子発現を誘導する。このプロモータを利用し、概日時計の発振における時計遺伝子産物(BMAL1およびBMAL2)の機能を明らかにすべく、これらBMALのドミナントネガティブ体を松果体特異的に発現するトランスジェニックゼブラフィッシュを複数系統樹立した。現在、これら個体のメラトニンリズムの解析を進めている。これと並行して、エクソロドプシンプロモータにおいて、松果体特異的な遺伝子発現を誘導するエレメントを決定しPIPE(Pineal Expression Promoting Element)と命名した。