脂質修飾にスポットライトをあてたG蛋白質と光シグナリングの解析

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交付申請書に記載の研究実施計画に沿って研究を遂行し、下記の成果を得た。Gtγ-C71stopノックインマウスの視細胞の解析: 網膜光受容細胞のG蛋白質トランスデューシンの脂質修飾の役割を調べるため、イソプレニル化Cys残基を欠失したトランスデューシンγサブユニット(非修飾型Gtγ)を発現する組換えマウス(C71stopマウス)を用いて,以下の解析を行った。1)C71stopマウスの網膜より膜試料を調製して生化学的な解析を行い、発現しているGtγのC末端修飾の欠失を確認した。2)Gtγをはじめとする一群の光シグナル伝達系タンパク質の網膜における発現レベルを特異的抗体を用いて調べた結果、C71stopマウス網膜においてはGtαサブユニットの蛋白質発現量が野生型と比べて大きく減少していることが判明した。3)電気生理学的手法(ERG)を用いた個体レベルでの解析によりC71stopマウス網膜の光反応を調べたところ、視細胞(桿体)に由来する成分が野性型マウスの場合と比較して著しく減弱していることがわかった。概日光受容蛋白質メラノプシンの解析: 前年度の研究により,時計組織であるニワトリ松果体には2種類のメラノプシン遺伝子(Opn4-1およびOpn4-2)が発現し,さらに各遺伝子につき2種類のスプライスバリアント(LおよびS)が存在することがわかっている。そこで,これらのスプライスバリアントを培養細胞HEK293において強制発現させ,発色団11-cis-retinalとの再構成を試みたところ,Opn4-1SおよびOpn-4-2L試料において色素の生成が確認された。さらに,これらの色素を粗精製して分光学的解析を行ったところ,それぞれの吸収極大波長は476nmおよび484nmと推定され,いずれのメラノプシンアイソフォームも青色感受性の光受容体であることが明らかになった。