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小胞体膜におけるペプチド輸送マシーナリーの構造生物学

内质网膜肽转运机制的结构生物学

基本信息

批准号：
13033027
负责人：
小林綾子
金额：
$ 1.92万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

小胞体膜ペプチド輸送マシーナリーの要となるATP駆動型ペプチド輸送体TAP(Transporter associated with antigen processingの略称)とその新ファミリーTAPL(TAP-Like)の構造と機能を明らかにする目的で、以下の研究を行った。1)TAPL発現安定細胞株と輸送活性測定系の構築昨年度に構築した、TAPLを安定高発現するハエ由来培養細胞S2細胞株におけるTAPLの細胞内発現部位を決定し、小胞体並びにリソソームにおける発現を明らかにした。更にこの細胞より調製した膜画分からのTAPL蛋白の可溶化条件を検討した結果、Triton X-100による可溶化に成功した。膜画分における発現量はおよそ1%であった。この蛋白画分を用いてTAPLのATP結合活性をnucleotide-binding columeを用いて解析した。その結果、ABC輸送体に特徴的なATP-agarose, ADP-agaroseに対する結合を検出した。さらに基質依存のATPase活性をみるためのアッセイ法を習得したので、基質ペプチド依存の輸送活性を検討することが可能となった。2)TAPL高発現酵母の作成結晶解析に必要量の蛋白を精製するには、昆虫細胞より酵母を用いるほうが容易であるが、外来異種蛋白の場合、分解される恐れがある。TAPやTAPLと同じABC輸送体のBサブファミリーに属するMDR1(薬物排出ポンプ)を安定発現するプロテアーゼ欠損株を入手し、TAPL発現株を作成した。3)TAPL発現大腸菌からの可溶化の検討膜貫通領域を含まず、C末端にhistidine tagを連結したABC領域を含む部分構造体を発現する大腸菌より可溶化条件を検討した。8Murea存在下でNiアフィニティカラムで精製する条件を見出した。

The structure and function of TAP(Transporter associated with antigen processing) and TAPL(TAP-Like) were studied. 1) Construction of TAPL stable cell line and transport activity assay system. Construction of TAPL stable cell line and transport activity assay system. Determination of TAPL intracellular expression site from cultured cell line S2. Furthermore, the solubilization conditions of TAPL protein in the cell membrane were investigated and the solubilization of Triton X-100 was successful. The amount of film produced is 1% of the total. This protein molecule is used to analyze the ATP binding activity of TAPL. As a result, ABC transporter characteristics of ATP-agarose, ADP-agarose in combination with The substrate dependent ATPase activity was studied by the method of learning and substrate dependent transport activity. 2) The necessary amount of protein for crystallization analysis of TAPL high-producing yeast can be purified easily by insect cells or yeast, and foreign heterologous protein can be decomposed easily. TAPL and ABC carrier B phase separation belongs to MDR1(substance discharge), stable development, and failure to produce TAPL. 3)TAPL develops E. coli and solubilizes the membrane through the domain containing the C-terminal histidine tag and ABC domain containing the partial structure. 8 In the presence of Murea, the conditions for purification are shown.