DNA修復酵素を用いた突然変異特異的クローニング法の確立

利用DNA修复酶建立突变特异性克隆方法

• 批准号: 14013052
• 负责人: 塚本 俊彦
• 金额: $ 2.69万
• 依托单位: Kitasato University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14013052/
• 关键词: 大腸癌; 突然変異

1)Microsatellite Instability(MSI)陽性大腸癌の突然変異特異的クローニング法による解析Microsatelite instability陽性大腸癌のうち、40%以上のmicrosatelliteでinstabilityのある病変(MSI-H)よりstrand-switch法を用いてcDNA libraryを作成する。隣接する正常組織より同様にcDNA libraryを作成した。これらをhybridizeさせ、A/Gミスマッチ特異的glycosylaseである大腸菌MutY、またはT/Gミスマッチ特異的glycosylaseであるhuman Thymine-DNA glycosylase(hTDG)を作用させ、さらにEDTA存在下でChitin binding domainをN末端に融合させたhuman AP endonuclase 1(hAPE1)を結合させ、Chitin beadsでpull-downした。Pull-downしたDNAをvectorにligationさせ大腸菌に導入しクローン化した。2次スクリーニングを行い、陽性cloneをsequenceし現在解析中である。2)大腸癌肝臓転移転移病巣における突然変異特異的クローニング法による解析転移特異的な、遺伝子の突然変異があるかどうかを、大腸癌の転移巣と原発巣を用い、上記1)の方法で現在解析中である。

1)Microsatellite Instability(MSI)-positive colorectal cancer suddenly changed into a specific disease (MSI-H)-strand-switch method to analyze microsatellite instability-positive colorectal cancer. More than 40% of Microsatelite instability was generated using cDNA library. A cDNA library was created for adjacent normal tissues. The A/G/S specific glycosylase acts on human Thymine-DNA glycosylase(hTDG) in the presence of EDTA and the N-terminal fusion of human AP endonuclease 1(hAPE1) in the presence of Chitin beads. Pull-down DNA vector ligation 2 times the clone sequence is resolved. 2)The method described in above 1) can be used to analyze the sudden and specific changes in colorectal cancer liver metastasis and metastasis, the sudden changes in genes, and the metastasis and origin of colorectal cancer.

项目成果

Furukawa, T., Konishi, F., Shitoh, K., Kojima, M., Nagai, H., Tsukamoto, T.: "Densely methylated MLH1 promoter correlates with decreased mRNA expression in sporadic colorectal cancers"Genes, Chromosomes & Cancer. 35. 1-10 (2002)

Furukawa, T.、Konishi, F.、Shitoh, K.、Kojima, M.、Nagai, H.、Tsukamoto, T.：“密集甲基化的 MLH1 启动子与散发性结直肠癌中 mRNA 表达降低相关”基因、染色体

Furukawa, T., Konishi, F., Shitoh, K., Kojima, M.Nagai, H., Tsukamoto, T: "Evaluation of screening strategy for detecting hereditary nonpolyposis colorectal cancer"Cancer. 94. 911-920 (2002)

Furukawa, T.、Konishi, F.、Shitoh, K.、Kojima, M.Nagai, H.、Tsukamoto, T：“检测遗传性非息肉病性结直肠癌的筛查策略的评估”癌症。