ES細胞のinvitro分化系とRNA干渉法を用いたヘパラン硫酸/ヘパリンの解析

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ヘパラン硫酸/ヘパリンは、三次元的に特異的に呈示される分子中のウロン酸や硫酸化等のマイナスチャージなどがいわゆるヘパリン結合性の生理活性蛋白質との相互作用を引き起こし、その結果、生体の発生、分化、恒常性維持に関わる重要な糖質分子である。本申請課題ではヘパラン硫酸/ヘパリンのN-硫酸化を、細胞生物学手法が適用できる系を用いて、よりin vivoにより近い結果を得ると共に、哺乳類では4種類存在するNDST (NDST1,2,3,4)のアイソザイムの機能分担や特異性等についても明らかにすることを目的とし、研究を行った。まず、データベース等を利用して干渉効果が期待される配列を各アイソザイムに関し少なくとも3ケ所見い出し、それらの配列を有する1)二本鎖RNAの合成及び2)ヘアピンRNAをヒトU6プロモーター制御下に発現するベクターの構築を行った。マウスNDSTの各アイソザイムが強制発現可能なCHO-K1あるいはHEK293細胞を用いて、上記配列の有用性を検証したところ、各アイソザイムに関し少なくとも1ケ所干渉効果を有する配列を同定した。次に、ヒトU6プロモーターをTetracycline Repressorの制御下におくことを考え、転写開始点の上流21bpをTetracycline Repressorが結合可能なTetracycline Operatorに置換した人工プロモーターを持ち、相同的組換え部位(FRT)を組み込んだベクターを構築した。ヒトH1プロモーターに関しても、市販DNAを出発材料として同様なベクターを構築した。前記ベクター中のプロモーターが効率的に機能するように、相同的組換え部位(FRT)及び、Tetracycline Repressorを恒常的に発現するためのユニット(pcDNA6/TR)を導入したES細胞(D3)を樹立した。現在、樹立した細胞の特徴付けを行っている。