ES細胞のinvitro分化系とRNA干渉法を用いたヘパラン硫酸/ヘパリンの解析

利用ES细胞体外分化系统和RNA干扰法分析硫酸乙酰肝素/肝素

• 批准号: 15040223
• 负责人: 相川 順一
• 金额: $ 1.73万
• 依托单位: The Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15040223/
• 关键词: heparan sulfate; heparin; N-deacetylase; N-sulfotransferase; ES cell; RNAi; ヘパラン硫酸; ヘパリン; CHO-K1細胞; siRNA

ヘパラン硫酸/ヘパリンは、三次元的に特異的に呈示される分子中のウロン酸や硫酸化等のマイナスチャージなどがいわゆるヘパリン結合性の生理活性蛋白質との相互作用を引き起こし、その結果、生体の発生、分化、恒常性維持に関わる重要な糖質分子である。本申請課題ではヘパラン硫酸/ヘパリンのN-硫酸化を、細胞生物学手法が適用できる系を用いて、よりin vivoにより近い結果を得ると共に、哺乳類では4種類存在するNDST (NDST1,2,3,4)のアイソザイムの機能分担や特異性等についても明らかにすることを目的とし、研究を行った。まず、データベース等を利用して干渉効果が期待される配列を各アイソザイムに関し少なくとも3ケ所見い出し、それらの配列を有する1)二本鎖RNAの合成及び2)ヘアピンRNAをヒトU6プロモーター制御下に発現するベクターの構築を行った。マウスNDSTの各アイソザイムが強制発現可能なCHO-K1あるいはHEK293細胞を用いて、上記配列の有用性を検証したところ、各アイソザイムに関し少なくとも1ケ所干渉効果を有する配列を同定した。次に、ヒトU6プロモーターをTetracycline Repressorの制御下におくことを考え、転写開始点の上流21bpをTetracycline Repressorが結合可能なTetracycline Operatorに置換した人工プロモーターを持ち、相同的組換え部位(FRT)を組み込んだベクターを構築した。ヒトH1プロモーターに関しても、市販DNAを出発材料として同様なベクターを構築した。前記ベクター中のプロモーターが効率的に機能するように、相同的組換え部位(FRT)及び、Tetracycline Repressorを恒常的に発現するためのユニット(pcDNA6/TR)を導入したES細胞(D3)を樹立した。現在、樹立した細胞の特徴付けを行っている。

ヘ パ ラ ン sulfuric acid / ヘ パ リ ン は, three yuan に specific に presented さ れ る molecule の ウ ロ や ン acid sulfate etc. の マ イ ナ ス チ ャ ー ジ な ど が い わ ゆ る ヘ パ リ ン associativity の physiologically active protein と の interaction を lead き up こ し, そ の results, the raw body の 発 raw, differentiation, and constancy to maintain に masato わ る important な sugar molecules で あ る. This application subject で は ヘ パ ラ ン sulfuric acid / ヘ パ リ ン の N - sulfating を and techniques of cell biology, が applicable で き を る department with い て, よ り in vivo に よ り nearly い results る を と に, mammals で は 4 species exist す る NDST (NDST1, 2 and 4) の ア イ ソ ザ イ ム の functions share や specificity に つ い て も Ming ら か に す る こ と を purpose と し line, research を っ た. ま ず, デ ー タ ベ ー ス を use し て dry involved working fruit が expect さ れ る match column を each ア イ ソ ザ イ ム に masato し less な く と も い し, 3 ケ see そ れ ら の match column を have す の る) 1 2 lock RNA synthesis and び 2) ヘ ア ピ ン RNA を ヒ ト U6 プ ロ モ ー タ ー under the system of imperial に 発 now す る ベ ク タ ー の line build を っ た. マ ウ ス NDST の each ア イ ソ ザ イ ム が 発 may now compulsory な CHO - K1 あ る い は を HEK293 cells with い て, written with column の usefulness を 検 card し た と こ ろ, various ア イ ソ ザ イ ム に masato し less な く と も 1 ケ dry involved working fruit を have す る match column を be し た. に, ヒ ト U6 プ ロ モ ー タ ー を Tetracycline Repressor の under the system of imperial に お く こ と を initiated え, planning to write の high 21 bp を Tetracycline Repressor が combination may な Tetracycline Operator に replacement し た artificial プ ロ モ ー タ ー を hold ち, the same group in え parts (FRT) を み 込 ん だ ベ ク タ ー を build し た. ヒ ト H1 プ ロ モ ー タ ー に masato し て も, vendor DNA を out 発 materials と し て with others な ベ ク タ ー を build し た. In the former record ベ ク タ ー の プ ロ モ ー タ ー が sharper rate に function す る よ う に, the same group in え parts (FRT) and び, Tetracycline Repressor を constant に 発 now す る た め の ユ ニ ッ ト (pcDNA6 / TR) を import し た ES cells (D3) を set し た. Now, establish the characteristics of the た cell <s:1> to けを rows って る る.

项目成果

ヘパラン硫酸/ヘパリンの生合成とN-アセチルグルコサミン・脱N-アセチル酵素/グルコサミン・N-硫酸転移酵素に関する最近の話題

关于硫酸乙酰肝素/肝素生物合成和 N-乙酰葡糖胺/脱 N-乙酰酶/葡糖胺/N-磺基转移酶的最新主题

• 发表时间: 2004
• 期刊: 日本農芸化学会誌 78
• 作者: Pohlschmidt;M.;et al.;相川 順一
• 通讯作者: 相川 順一