ヘパラン硫酸/ヘパリン・脱N-アセチル/N-硫酸転移酵素の構造と機能の解析

硫酸乙酰肝素/肝素/脱N-乙酰基/N-磺基转移酶的结构与功能分析

• 批准号: 13760077
• 负责人: 相川 順一
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: The Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13760077/
• 关键词: ヘパラン硫酸; ヘパリン; N-硫酸転移酵素; 脱N-アセチル酵素; heparan sulfate; heparin; N-deacetylase; n-sulfotransferase; localization; interaction

1.N-硫酸転移酵素ドメインの生産と解析前年度に得られたマウス・脱N-アセチル/N-硫酸転移酵素(NDST)1のN-硫酸転移酵素ドメインはヘパリンと高い親和性を示すものの、N-硫酸を含まないヘパロサンへの親和性はそれより低下していることが、表面プラズモン共鳴によって明らかになった。引き続き、ハエおよび線虫のN-硫酸転移酵素ドメインの大腸菌における発現系の構築を行ったが、マウスNDSTの生産量に比べ、ハエでは1/2、線虫では1/10に低下していた。アミノ酸コドンの片寄りが原因の一つと考えられたため、特定のtRNAが増強された大腸菌を宿主として生産を試みたが、相互作用を解析するのに必要な量は得られなかった。2.局在性解析を目指したマウス・NDSTの安定発現細胞の樹立前年度までに、FLAGのタグをC末につけた形のマウス・NDST各アイソザイムの発現をCHO-K1細胞変異株において試みたが、樹立した細胞間では各アイソザイムの発現が不均一であった。そこで、外来遺伝子を染色体の特定の部位に挿入でき、なおかつその発現を薬剤(テトラサイクリン等)によって制御できる系の利用を試みた。HEK293細胞で樹立した各アイソザイムのクローンでは、その発現が薬剤依存的であったが、アイソザイムの発現は、相対的にNDST1、2で高く、NDST3、4で低かった。現在、アイソザイムの発現量を揃えるため、濃度依存的な発現が誘導可能な薬剤(ドキシサイクリン)を用いた実験を行っている。3.脱N-アセチル酵素ドメインの構造と機能の解析キチン・脱N-アセチル酵素など他の脱N-アセチル酵素とのアミノ酸配列の相同性を利用して、ヒトNDST3の脱N-アセチル化反応に関わるアミノ酸残基の同定を行うため、10ケ所の部位の特異的変異を行った。既に、発現可能な形に構築し終えており、現在発現細胞の樹立を行っている。

1. N-Sulphate Transferase (NDST)1 N-Sulphate Transferase (NDST)1 N-Sulphate Transferase (NDST) 2 N-Sulphate Transferase (NDST)1 N-Sulphate Transferase (NDST) 1 N The production of N-sulfate transferase in E. coli was 1/2 and 1/10 lower than that in E. coli. A study of the causes of infection, enhancement of specific tRNA, production of E. coli, analysis of interactions, and the necessary amount 2. The analysis of NDST stability indicates that the development of CHO-K1 cells is not uniform before the establishment of FLAG. The gene expression of the alien gene is detected in a specific part of the chromosome, and the gene expression of the alien gene is detected in a specific part of the chromosome, and the gene expression of the alien gene is detected. HEK293 cells are established in the presence of a variety of organisms, including NDST1 and 2, NDST3 and 4. Now, the concentration dependent occurrence of the drug can be induced by the concentration dependent occurrence. 3. The structure and function analysis of DNST3 enzyme and DNST3 enzyme were analyzed by using the similarity of DNST3 enzyme and DNST3 acid residues. Since it is possible to form a structure, it is possible to form a cell.

项目成果

M.A.S.Pinhal, B.Simth, S.Olson, J.Aikawa, K.Kimata, J.D Esko: "Enzyme Interaction in Heparan Sulfate Biosynthesis : Glucuronic acid C5 epimerase and 2-0-sulfortransferaseinteract in vivo"Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98. 12984-12989 (2001)

M.A.S.Pinhal、B.Simth、S.Olson、J.Aikawa、K.Kimata、J.D Esko：“硫酸乙酰肝素生物合成中的酶相互作用：葡萄糖醛酸 C5 差向异构酶和 2-0-硫基转移酶在体内相互作用”Proc。

相川 順一: "ヘパラン硫酸/ヘパリンの生合成におけるN-アセチルグルコサミン・脱N-アセチル酵素/グルコサミン・N-硫酸転移酵素(N-deacetylase/N-sulfotransferase)の役割"生化学. 73. 479-483 (2001)

Junichi Aikawa：“N-乙酰葡糖胺/N-脱乙酰酶/N-磺基转移酶在硫酸乙酰肝素/肝素生物合成中的作用”《生物化学》73. 479-483 (2001)。

J.Aikawa, K.Kojima-Aikawa, M.Tsujimoto: "Biological functions of N-deacetylase/N-sulfotransferase in the biossynthesis of heparan sulfate/heparin"Riken Review. 41. 35-37 (2001)

J.Aikawa、K.Kojima-Aikawa、M.Tsujimoto：“N-脱乙酰酶/N-磺基转移酶在硫酸乙酰肝素/肝素生物合成中的生物学功能”Riken Review。

J.Aikawa: "Handbook of Glycosyltransferases and their related genes"Springer-Verlag, Tokyo. 6 (2001)

J.Aikawa：“糖基转移酶及其相关基因手册”Springer-Verlag，东京。