权益分类	功能权益	普通用户	{{item.name}}会员
{{category.name}}	{{benefitItem.name}}

癌遺伝子産物による糖蛋白質特異的な糖転移酵素群の活性発現制御機構の解析

癌基因产物对糖蛋白特异性糖基转移酶活性表达的调控机制分析

基本信息

批准号：
07760317
负责人：
相川順一
金额：
$ 0.64万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07760317/
关键词：
ヒトIL5 NIH3T3 V-src V-sis V-erbB V-K-ras

项目摘要

ヒトIL5をモデル糖蛋白質として、V-src、V-sis、V-erbB、V-K-rasの糖蛋白質特異的な糖転移酵素群の活性発現制御機構の解析を試みるべく実験を行った。JCRBより入手したヒトIL5遺伝子を鋳型に、そのN末部分は翻訳効率上昇のためKozak配列を導入する一方、C末はmRNAの安定性向上のため3′非翻訳領域を欠失させるようにPCRを行った。得られたDNA断片をCAGプロモーターを持つpCAGGSに導入した(pCAG-2)後、さらにプラストサイジンS耐性遺伝子を導入して、ヒトIL5安定発現用プラスミドpCAG5-2BSDを得た。pCAG5-2BSDを正常株NIH3T3及びその癌遺伝子導入株V-src-NIH3T3、V-sis-NIH3T3、V-erbB-NIH3T3、V-K-ras-NIH3T3に導入し、薬剤耐性コロニーを得た。これらの株をMEM+10%仔牛血清の培地を用いて培養したところNIH3T3では1ng/ml、癌遺伝子導入株では10-20ng/mlのヒトIL5を産生していることがELISA法により明らかになった。ヒトIL5を産生するNIH3T3株を用いて培地からのヒトIL5の精製を考慮し、血清成分の低減化が可能なopti-MEMを基本培地に血清成分の低減化を試みたところ、1%及び2%仔牛血清存在下では形態変化を引き起こしたため、生産には不向きであると考えられる一方、4%仔牛血清存在下では形態変化を引き起こさず、生産量もMEM+10%仔牛血清と同等であった。以上により、この培地組成によりNIH3T3及びその癌遺伝子導入株でのヒトIL5の生産が可能であると考えられる。

Analysis of the activity regulation mechanism of glycoprotein-specific glycoproteins such as IL-5, V-src, V-sis, V-erbB and V-K-ras JCRB starts with IL-5 gene expression, and the N terminal part of the gene expression increases in Kozak alignment. After the introduction of pCAGGS (pCAG-2), the introduction of IL5 resistant gene and the stable development of pCAG5 -2BSD were obtained. pCAG5 -2BSD was introduced into normal NIH 3T3 and V-src-NIH 3T3, V-sis-NIH 3T3, V-erbB-NIH 3T3 and V-K-ras-NIH 3T3, and the resistance to pCAG5 - 2BSD was obtained. The cells were cultured with MEM+10% calf serum at 1ng/ml for NIH 3T3 and 10-20ng/ml for IL5 production by ELISA. Production of IL-5 by NIH-3T3 strain in medium culture and purification of IL-5 in medium culture. Reduction of serum composition by 1% and 2% calf serum. Production MEM+10% calf serum equivalent The above results show that NIH 3T3 and IL5 can be produced by introducing the cancer gene into the culture medium.